Gundari†Alamat si genduari: OX11 0DE, Inggris, Gedung Berlian, Taman Ilmu Pengetahuan ras Inovasi Harwell, Dietcote, Oxfordshire, Inggris, Sumber Cahaya Berlian Co., Ltd., Pusat Pencitraan Biologis Elektronik.
Pusat reaksi kompleks panen cahaya 1 (RC-LH1) eme komponen fotosintesis inti bakteri fototrofik ungu. Iperkenalken kami dua struktur mikroskop krio-elektron kompleks RC-LH1 i bas Rhodopseudomonas palustris nari. Struktur resolusi 2,65-Å kompleks RC-LH114-W terdiri ibas 14 subunit LH1 loop si ngelilingi RC, si terganggu protein W, sedangken kompleks si la lit protein-Wna lengkap komposisi RC si ikelilingi RC. Tutup 16 subunit LH1 lingkaran. Perbandingen struktur enda mereken wawasen kerna dinamika kinon i bas kompleks RC-LH1, termasuk perubahen konformasi si lenga itentuken sebelumna sanga ngiket kinon i situs QB RC, bage pe ingan situs pengikat kinon bantu, si nampati Pass ia ku RC. Struktur protein W si unik e mencegah penutupen loop LH1, alu bage tercipta saluren guna mempercepat pertukaran kinon/kinolon.
Energi si isediaken fotosintesis banci mpertahanken hampir kerina kegeluhen i doni enda, janah mbelin kel potensina guna bioteknologi surya. Sanga mendorong fotosintesis global, bakteri fototrofik ungu pe ncidahken erbage-bage mode energi ras kemampuan metabolisme. Kalak enda banci menghindari fotosintesis ras turah jadi bakteri heterotrofik i bas gelap, banci mpehuli nitrogen ras karbon dioksida, menghasilken hidrogen, ras mendegradasi senyawa aromatik (1-3). Guna mereken energi man proses-proses enda, cahaya arus pedas ras mehuli iubah jadi energi kimia. Proses enda ibenaken tupung kompleks antena si menjebak cahaya nyerep cahaya ras mentransfer energi si terperangkap ku pusat reaksi (RC), alu bage mulai me pemisahan muaten (4 – 7). Unit dasar fotosintesis ibas bakteri fototrofik ungu terdiri ibas RC tipe 2, si ikelilingi kompleks panen cahaya 1 (LH1), membentuk kompleks inti RC-LH1. LH1 terbentuk arah rangkaian heterodimer αβ si melengkung, masing-masing ngiket dua molekul klorofil bakteri (BChl) sada ras sada ntah dua karotenoid (8-12). Antena LH1 si paling sederhana terdiri ibas 16 ntah 17 heterodimer αβ si mengelilingi RC (9-13) ibas loop tertutup, tapi ibas kompleks inti si deban, peptida transmembran mengganggu kelanjuten LH1 si mengelilingi , Alu bage mendorong difusi kinol/kinon ras kompleks bRC1, 13-15). Tumbuhen fototrofik ungu Rhodopseudomonas (Rps.) eme sada organisme model si banci ngangkai perpindahen energi ras elektron si mendukung fotosintesis. Struktur kristal si pemena eme Rps. Model kompleks RC-LH1 palustris eme RC, ikelilingi 15 lingkaran LH1 heterodimer, si iganggu protein si la itandai si igelari “Protein W” (14). Protein-W selanjutna itandai sebage RPA4402, eme protein 10,5kDa si la berkarakter ras telu heliks transmembran (TMH) si iprediksi (16). Iusulken kami gelah iganti gelar gen rpa4402 si ngkodeken protein W jadi pufW gelah sentudu ras nomenklatur si ipake man gen si ngkodeken subunit RC-L, M (pufL, pufM) ras LH1α, β (pufA, pufB). Si menarik, protein-W hanya lit ibas sekitar 10% RC-LH1, si ngungkapken Rps. palustris menghasilken dua kompleks RC-LH1 si berbeda. I jenda, ilaporken kami struktur krio-EM (krio-EM) resolusi tinggi dua kompleks inti, sada si lit protein W ras 14 heterodimer αβ, sada nari si la lit protein W ras loop LH1 16 Heterodimer si tertutup. Strukturta mewakili perubahen langkah ibas pemahamen kompleks RC-LH1 Rps. palustris, erkiteken enggo si analisa populasi homogen tiap varian ras lit resolusi si cukup guna jelas menetapken tiap peptida ras pigmen si terikat ras lipid ras kinon si terkait. Perbandingen struktur enda ncidahken maka telu protein TMH-W si lenga lit i bas kompleks RC-LH1 si deban sedekah enda menghasilken saluren kinon guna mempercepat pertukaran kinon/kinolon. Sejumlah situs pengikat lipid ras kinon si terkonservasi enggo iidentifikasi, janah enggo si ungkapken perubahen konformasi si mbaru kenca kombinasi kinon ras RC, si mungkin cocok man fotosistem II (PSII) RC organisme fototrofik si beroksigen. Temuen kami mereken wawasen si mbaru kerna kinetika pengikatan ras pertukaran kinon/kinolon i bas kompleks inti RC-LH1 bakteri fototrofik ungu.
Guna mempermudah penelitian si rinci kerna dua kompleks si lit i bas Rps. palustris, isolasi kami tiap RC-LH1 alu cara biokimia. Kompleks protein W-defisiensi (selanjutna ikataken ΔpufW) imurniken i bas galur si la lit gen pufW (16), janah sada ngenca kompleks RC-LH1 si banci ihasilken. Kompleks si mengandung protein W e ihasilken sada galur. Protein W galur enda imodifikasi alu tag His 10x i C-terminus-na, seh maka kompleks si mengandung protein W banci secara efektif igabungken ras protein W si paling kurang alu imobilisasi logam. Kompleks e ipisahken alu mehuli (16) Kromatografi Afinitas (IMAC).
Bagi si teridah ibas gambar 1, duana kompleks e lit telu sub-unit RC (RC-L, RC-M ras RC-H) si ikelilingi antena LH1. Struktur 2,80-A kompleks si kurang protein-W ncidahken 16 heterodimer αβ, membentuk lingkaran LH1 si tertutup si lengkap ngelilingi RC, si selanjutna igelari kompleks RC-LH116. Struktur 2,65Å kompleks si mengandung protein-W lit 14-heterodimer LH1 si iganggu protein-W, si selanjutna igelari RC-LH114-W.
(A ras B) Representasi permukaan senyawa e. (C ras D) Pigmen si terikat si iekspresiken i bas batang. (E ras F) Kompleks si iperdiateken arah permukaan sitoplasma lit peptida ras subunit LH1 si iwakili i bas kartun, janah ibereken nomor searah jarum jam arah celah protein-W [konsisten ras penomoren Rba. kompleks sferoid (13)]. Bagi LH1-α, warna subunit proteinna eme kuning; bagi LH1-β, warna subunit protein e biru; bagi protein-W, protein e megara; bagi RC-H, ia me cyan; bagi RC-L, eme Oranye; bagi RC-M, warnana megara. Kofaktor iwakili alu batang, warna hijau mewakili molekul BChl ras BPh a, ungu mewakili karotenoid, ras warna kuning mewakili molekul UQ10. (G ras H) Pemandangan si ipebelin kerna celah protein-W i bas daerah si setara kompleks RC-LH114-W (G) ras kompleks RC-LH116 (H). Kofaktor itampilken ibas bentuk pengisian ruang, kinon kelat itampilken alu warna biru. Celah protein-W isoroti alu garis putus-putus biru i bas (G), ras lubang-lubang kitik ingan kinon/kinolol meresap i bas cincin LH116 isoroti alu garis putus-putus hitam i bas (H).
Gambar 1 (A ras B) ncidahken RC si ikelilingi array heterodimer LH1αβ si terbuka ntah pe tertutup, si masing-masing ngiket dua BChl ras sada karotenoid (Gambar 1, C ras D). Penelitian sebelumna enggo ncidahken maka Rps eme kompleks LH1. I bas jalur biosintesis xantin spirulina, spesies enda mengandung populasi karotenoid si ercampuren (17). Tapi, spiropirroksantin eme karotenoid si dominan ras kepadatenna memuasken. Emaka, ipilih kami model spiroxanthin i bas kerina ingan pengikat LH1. Polipeptida alfa ras beta eme TMH tunggal si daerah luar membranna gendek (Gambar 1, A, B, E, ras F). Aminna pe la iperdiateken kepadaten 17 residu i C-terminus, tapi polipeptida alfa ibelah i bas Met1 nari ku Ala46 i bas duana kompleks e. β polipeptida i reduksi i bas Gly4 nari jadi Tyr52 i bas RC-LH116, ras i bas Ser5 nari jadi Tyr52 i bas RC-LH114-W. La lit kepadaten 3 ntah 4 N-terminal ntah pe 13 residu C-terminal si iperdiatekenna (Gambar S1). Analisis spektrometri massa kompleks RC-LH1 campuren si isikapken arah strain tipe liar ncidahken maka daerah si hilang e me hasil pembelahen heterolog peptida enda (Gambar S1 ras S2). Formilasi N-terminal α-Met1 pe iperdiateken (f). Analisis ncidahken maka α-peptida terdiri ibas residu fMet1 seh ku Asp42/Ala46/Ala47/Ala50, ras β-peptida terdiri ibas residu Ser2 seh ku Ala53, si setuju alu mehuli ras peta kepadaten EM suhu rendah.
Koordinasi α-His29 ras β-His36 erbahanca BChls tatap muka; tiap heterodimer αβ erkumpul ras tetanggana guna membentuk lingkaran terbuka (RC-LH114-W) ntah pe lingkaran tertutup (RC-LH116) i sekelewet RC Array pigmen si igabungken eksiton (Gambar 1, C ras D). Adi ibandingken ras pita 877 nm RC-LH114-W, pergeseren merah serapan 880 nm RC-LH116 eme 3 nm (Gambar 2A). Tapi, spektrum dikroisme melingkar hampir seri (Gambar 2B), si ncidahken maka aminna pe lit perbedan si jelas antara loop terbuka ras tertutup, lingkungen lokal BChls mirip kel. Pergeseren merah penyerapan banci jadi hasil gerak termal si berkurang ras stabilitas si meningkat i bas loop tertutup (18, 19), perubahen kopling pigmen si ibahan loop tertutup (20, 21), ntah pe kombinasi dua efek enda (11).
(A) Spektrum penyerapan ultraviolet/teridah/inframerah dekat, puncakna itandai alu pigmen si sesuai ras inormalisasi ku puncak BPh i bas 775 nm. (B) Spektrum dikroisme melingkar si inormalisasi ku absorbansi BChl i bas 805 nm. (C ras D) Spektrum ΔA si ipilih arah spektrum penyerapan si iselesaikan waktu kompleks RC-LH114-W (C) ras kompleks RC-LH116 (D). Gelah lebih mehuli perbandingenna, kerina spektrum inormalisasi jadi ∆A i bas −A i bas 0,2 ps. (E) Laju oksidasi sitokrom c2 kenca iradiasi ibas litna erbage konsentrasi UQ2 (nen Gambar S8 guna data mentah). (F) I bas sel-sel si turah i teruh cahaya si intensitasna rendah, menengah ntah pe tinggi (10, 30 ntah pe 300μMm-2 s-1, masing-masing), subunit protein W ras RC-L i bas kompleks si imurniken ras rasio membran si terpisah. Tentuken kadar protein alu elektroforesis gel SDS-poliakrilamida ras imunoassay (nen Gambar S9 guna data mentah). Tentuken rasio relatif ras kompleks RC-LH114-W si enggo imurniken. Rasio stoikiometri RC-L ras protein-W kompleks e eme 1:1.
BChl si lit i bas posisi 1 i bas loop αβ14 si cacat RC-LH114-W (Gambar 1, A, C, ras E) lebih ndeher ras donor primer RC (P) 6,8Å asangken BChl si setara i bas RC-LH116 (Gambar. 1, B, D); tapi, kinetika penyerapan sementara dua kompleks e ncidahken maka man RC-LH114-W ras RC-LH116, konstanta waktu perpindahen energi eksitasi i bas LH1 nari ku RC eme 40 ±4 ras 44±3 ps (Gambar 2). , C ras D, Gambar S4 ras Tabel S2). Bagepe la lit perbedan si signifikan ibas transfer elektronik ibas RC (Gambar S5 ras teks tambahan si terkait). Icurigai kami maka korespondensi si ndeher antara waktu perpindahen energi antara LH1 ras RC-P erkiteken jarak, sudut ras energi potensial si seri i bas sebagian besar BChl i bas dua loop LH1. Teridah maka menjelajahi pola energi LH1 guna seh ku jarak minimum labo lebih pedas asangken transfer energi langsung ibas situs suboptimal nari ku RC. Loop LH1 si terbuka i bas RC-LH114-W banci ka mengalami gerak termal si la signifikan i bas kondisi suhu si rendah guna analisis struktural, janah lit konformasi cincin αβ14 si lebih gedang i bas suhu kamar arah jarak pigmentasi βBChls i bas posisi RC 1.
Kompleks RC-LH116 lit 32 BChl ras 16 karotenoid, janah susunenna secara keseluruhan seri ras si idatken i bas pidpidum Thermochromatium (Tch.) (12) ras ganggang si ijo (Blc.viridis) (PDB ID 6ET5) (10). Kenca enggo iselarasken, penyimpangan si kitik ngenca i bas posisi heterodimer αβ si iperdiatekenna, khususna 1-5, 15, ras 16 (Gambar S6). Kehadiren protein-W enda berdampak signifikan nandangi struktur LH1. Telu TMH-na ihubungken alu loop si gendek, alu N-terminal i sisi lumen kompleks ras C-terminal i sisi sitoplasma (Gambar 1A ras 3, A seh ku D). Protein-W sebagian besar hidrofobik (Gambar 3B), janah TMH2 ras TMH3 berinteraksi ras LH1αβ-14 guna membentuk permukaan transmembran (Gambar 3, B ras E seh ku G). Antarmuka si terutama terdiri ibas residu Phe, Leu ras Val ibas daerah transmembran. Sisa-sisa enda itumpuk alu asam amino hidrofobik ras pigmen αβ-14. Piga-piga residu kutub pe berkontribusi ibas interaksi e, termasuk ikatan hidrogen antara W-Thr68 ras β-Trp42 ibas permukaan rongga kompleks (Gambar 3, F ras G). I bas permukaan sitoplasma, Gln34 berdekatan ras kelompok keto karotenoid αβ-14. Selain si e, molekul n-dodesil β-d-maltosida (β-DDM) pe iselesaikan, janah ikur hidrofobikna ipebelang ku antarmuka antara protein-W ras αβ-14, janah ikur lipid banci saja lit i bas kula. Iperdiateken kami ka maka daerah resolusi C-terminal protein W ras RCH ndeher kel, tapi labo i bas lingkup membentuk interaksi tertentu (Gambar 1, A ras E). Tapi, banci saja lit interaksi i bas asam amino C-terminal si lenga terselesaikan i bas dua protein enda, si banci mereken mekanisme guna perekruten protein-W sanga perakiten kompleks RC-LH114-W.
(A) Protein-W, si menghadap antarmuka ras LH1αβ14 ibas bentuk kartun, lit rantai sampingna si berbentuk batang (merah), si itampilken ibas sada bagin diagram potensial elektrostatik (permukaan abu-abu transparan alu tingkat kontur 0,13). (B) Protein-W si iwakili alu permukaan si erwarna hidrofobik. Daerah kutub ras bermuatan itampilken alu warna cyan, daerah hidrofobik itampilken alu warna putih, ras daerah hidrofobik si megegeh itampilken alu warna oranye. (C ras D) Protein-W si iwakili i bas kartun, orientasina seri ras i bas (A) (C), janah iputar 180° (D). Rikutken posisi ibas uruten, residu si banci ibedaken mengadopsi skema warna pelangi, ija terminal N warnana biru ras terminal C warnana merah. (E) Protein-W ibas pandangan si seri ras ibas (A), ras residu-residu ibas antarmuka protein-W:LH1 iwakili alu batang si lit tanda-tanda si ipasang. (F) Protein-W iputar 90° relatif man (E) ras LH1αβ14 i bas gambaren kartun, ras relatif man residu antarmuka i bas gambaren batang. Sisa-sisa si nggantung i bas polipeptida beta nari ibereken label. Kofaktor icidahken sebage batang si cocok ras warna gambar 1, β-DDM si enggo terurai icidahken alu warna abu-abu, janah oksigen icidahken alu warna merah. (G) Pemandangan i bas (F) iputar 180°, alu residu si menonjol i bas polipeptida alfa si lit labelna.
Protein-W menggantiken sada heterodimer αβ (si pe-15-ken i bas Gambar 1F), alu bage banci mencegah penutupen loop ras miringken telu heterodimer αβ si pemena. Iperdiateken maka sudut kemiringan maksimal heterodimer αβ-1 si pemena relatif ras normal film eme 25° seh ku 29° (Gambar 1, A ras E), si terbentuk arah kemiringan 2° seh ku 8° αβ-1 i bas RC A kontras tajam-LH116 rasF (Gambar 1, B). Heterodimer si peduaken ras si peteluken miring 12° seh ku 22° ras 5° seh ku 10°. Erkiteken hambaten sterik RC, kemiringan αβ-1 la termasuk pasangan αβ si peduaken (si sesuai ras αβ si pe-16-ken i bas Gambar 1F), alu bage terbentuk celah si jelas i bas cincin LH1 (Gambar 1, A ras E) . Erkiteken kurangna dua heterodimer αβ, isertai hilangna empat BChl ras dua karotenoid, sada pe la lit karotenoid si terikat ku subunit αβ-1 si memutar, si erbahanca lit sada cincin LH114-W si mengandung 13 karotenoid Vegetarian ras 28 BChl. Perkiraan resolusi lokal dua kompleks i daerah αβ1 seh ku 7 lebih rendah asangken sisa loop LH1, si banci ncidahken plastisitas si melekat i bas subunit LH1 si berdekatan ras situs RC QB (Gambar 4) .
Gambar RC-LH114-W (A ras B) ras RC-LH116 (C ras D) icidahken arah tampilen atas/tampilen samping (A ras B) (A ras C) ras permukaan rongga si seri ras Gambar 1. (B ras D). Kunci si erwarna e icidahken i sebelah kanan.
Sada ngenca kompleks inti si deban si lit ciri khasna alu rasio stoikiometri 1:14 eme dimer RC-LH1-PufX (13). Tapi, protein W ras PufX la lit homologi si jelas, janah lit dampakna si signifikan nandangi struktur LH1 masing-masing. PufX eme sada TMH si lit domain sitoplasma N-terminal si berinteraksi ras sisi sitoplasma subunit RC-H (13) ibas posisi si sesuai ras Rps. 116αβ-16 si lit i bas ia. PufX erbahan saluren guna pertukaran kinon/kinolon antara RC-LH1 ras kompleks sitokrom bcl ras lit ibas kerina Rba. kompleks inti sferoid (13). Aminna pe antarmuka monomer-monomer lit ibas Rba. Dimer sphaeroides RC-LH1-PufX lit i bas posisi pengikat protein W i bas RC-LH114-W, janah celah si ibahan PufX ras protein-W lit i bas posisi si setara (Gambar S7A). Celah ibas RC-LH114-W pe sejajar ras saluren kinon hipotetis (8) Pseudomonas rosea LH1, si ibentuk peptida si la berhubungan ras protein W ntah pe PufX (Gambar S7B). Selain si e, saluren kinon i bas Blc. LH1 si warnana hijau zamrud si terbentuk alu ngeluari sada subunit γ (7) lit i bas posisi si seri (Gambar S7C). Aminna pe imediasi protein si berbeda, munculna saluren kinon/kinolol enda ibas posisi si seri ibas kompleks RC-LH1 tempa-tempa jadi contoh evolusi konvergen, si ncidahken maka celah si ibahan protein W banci bertindak sebage saluren kinon.
Celah ibas loop LH114-W memungkinken pembentuken daerah membran si terus menerus antara ruang internal kompleks RC-LH114-W ras membran massal (Gambar 1G), labo menghubungken dua domain e arah pori protein bagi ibas protein. Kompleks RC-LH116 enda mirip ras Tch si tertutup. Kompleks si bagi jarum (22) (Gambar 1H). Erkiteken difusi kinon arah membran lebih pedas asangken difusi arah saluren protein si sempit, maka loop LH114-W si terbuka banci erbahanca perputaren RC lebih pedas asangken loop LH116 si tertutup, janah difusi kinon ku bas RC banci lebih terbatas. Guna nguji apakah protein W mpengaruhi konversi kinon arah RC, ilakoken kami uji oksidasi sitokrom i bas konsentrasi tertentu ubikinon 2 (UQ2) (analog UQ10 alami alu ikur isopren si lebih gendek) (Gambar 2E). Aminna pe litna kinon si terkelat menghambat penentuan konstanta Michaelis si teridah alu akurat (RC-LH114-W ras RC-LH116 cocok guna 0,2±0,1μM ras 0,5±0,2μM, masing-masing), tapi tingkat maksimum RC-LH114-6-1. 28±5% lebih mbelin asangken RC-LH116 (3,6±0,1 e-RC-1 s-1).
Awalna iperkiraken kami maka protein-W lit i bas kira-kira 10% kompleks inti (16); ijenda, tingkat penghunian sel pertumbuhen cahaya rendah, cahaya menengah, ras cahaya tinggi eme 15±0,6%, 11±1% ras 0,9±0,5, masing-masing % (Gambar 2F). Perbandingen kuantitatif spektrometri massa ncidahken maka penambahan tag histidin la mengurangi kelimpahen relatif protein-W adi ibandingken ras strain tipe liar (P = 0,59), emaka kadar enda labo artefak protein-W si imodifikasi (Gambar S10). Tapi, penghunian protein-W si rendah enda i bas kompleks RC-LH1 banci erbahanca piga-piga RC banci terbalik alu kecepatan si ipepercepat, alu bage mengurangi pertukaran kinon/kinolon si lebih lambat i bas kompleks RC-LH116. Iperdiateken kami maka tingkat penghunian cahaya si tinggi la konsisten ras data transkriptomik si mbaru-mbaru enda, si ncidahken maka ekspresi gen pufW meningkat i teruh cahaya si megegeh (Gambar S11) (23). Perbedaan antara transkripsi pufW ras penggabungan protein-W ku bas kompleks RC-LH1 membingungken ras banci ncidahken pengaturen protein si kompleks.
I bas RC-LH114-W, 6 kardiolipin (CDL), 7 fosfatidilkolin (POPC), 1 fosfatidilgliserol (POPG) ras 29 molekul β-DDM ialokasiken ras imodelken i bas si e 6 CDL, 24 POPC, 2 POPGβDM ras 12. RC-LH116 (Gambar 5, A ras B). Ibas dua struktur enda, CDL hampir lit ibas sisi sitoplasma kompleks, sedangken POPC, POPG ras β-DDM sebagian besar lit ibas sisi luminal. Dua molekul lipid ras deterjen isolasi i bas daerah αβ-1 seh ku αβ-6 kompleks RC-LH114-W (Gambar 5A), ras lima isolasi i bas daerah setara RC-LH116 (Gambar 5B ). Lebih melala lipid si idat i bas sisi si deban kompleks, terutama CDL, si terkumpul antara RC ras αβ-7 seh ku αβ-13 (Gambar 5, A ras B). Lipid ras deterjen si deban si terselesaikan secara struktural lit i luar cincin LH1, janah rantai asil si terselesaikan alu mehuli erbelangna antara subunit LH1, secara tentatif itetapken sebage β-DDM i bas RC-LH114-W, ras iartiken sebage β-DDM i bas RC A campuren βPOPC-DHDM ras16. Posisi lipid kelat ras deterjen si seri ibas strukturta ncidahken maka ia merupaken situs pengikat si relevan secara fisiologis (Gambar S12A). Posisi molekul si setara ibas Tch pe lit konsistensi si mehuli. Lembut ras Trv. Galur 970 RC-LH1s (Gambar S12, B seh ku E) (9, 12) ras residu-residu ikatan hidrogen kelompok ulu lipid ncidahken konservasi si cukup mehuli i bas penjajaren uruten (Gambar S13), si ncidahken maka CDL si terkonservasi si terikat ku RC (24), situs-situs enda si terkonservasi i bas komp-L1.
(A ras B) Peptida RC-LH114-W (A) ras RC-LH116 (B) igambarkan alu kartun, janah pigmen igambarkan alu batang, alu make skema warna i bas Gambar 1. Lipid igambarkan alu warna merah, ras deterjen igambarkan alu warna abu-abu. UQ si terikat ku situs RC QA ras QB warnana kuning, sedangken UQ si terisolasi warnana biru. (C ras D) Pandangan si seri ras (A) ras (B), alu lipid si ilupaken. (E seh ku G) Pemandangan si ipebelin Q1(E), Q2(F) ras Q3(G) i bas RC-LH116 nari, alu rantai samping si saling mempengaruhi. Ikatan hidrogen e icidahken bagi garis putus-putus si warnana hitam.
I bas RC-LH116, baik RC QA bage pe QB UQ, si ikut i bas transfer elektron i bas proses pemisahan muaten, terurai i bas ingan pengikatna. Tapi ibas RC-LH114-W, QB kinon lenga terselesaikan ras ibahas secara rinci i teruh enda. Selain kinon QA ras QB, dua molekul UQ si terkelat (si lit i bas antara cincin RC ras LH1) ialokasiken i bas struktur RC-LH114-W sue ras kelompok takalna si enggo terselesaikan alu mehuli (si lit i bas Q1 ras Q2, masing-masing). jarak). Gambar 5C). Dua unit isopren itugasken ku Q1, janah peta kepadaten menyelesaikan 10 ekor isopren lengkap Q2. Ibas struktur RC-LH116, telu molekul UQ10 si terkelat (Q1 seh ku Q3, Gambar 5D) iselesaikan, janah kerina molekul lit kepadaten si jelas i belang-belang ikur (Gambar 5, D seh ku G). Ibas dua struktur e, posisi kelompok ulu kinon Q1 ras Q2 lit konsistensi si mehuli (Gambar S12F), janah ia hanya berinteraksi ras RC. Q1 lit i pintu masuk celah W RC-LH114-W (Gambar 1G ras 5, C, D ras E), janah Q2 lit i deher ingan pengikat QB (Gambar 5, C, D) ras F). Residu L-Trp143 ras L-Trp269 si terkonservasi ndeher kel ras Q1 ras Q2 janah mereken potensi interaksi π-stacking (Gambar 5, E ras F, ras Gambar S12). L-Gln88, 3,0 Å i bas oksigen distal Q1 nari, mereken ikatan hidrogen si megegeh (Gambar 5E); residu enda ikonservasi ibas kerina RC kecuali hubungen si paling ndauh (Gambar S13). L-Ser91 secara konservatif igantiken Thr ibas sebagian besar RC sideban (Gambar S13), eme 3,8 Angstrom ibas metil oksigen Q1 nari, ras banci mereken ikatan hidrogen si lemah (Gambar 5E). Q3 teridah la lit interaksi si spesifik, tapi lit i bas daerah hidrofobik antara subunit RC-M ras subunit LH1-α 5 seh ku 6 (Gambar 5, D ras G). Q1, Q2 ras Q3 ntah pe kinon kelat si ndeher pe enggo iselesaikan i bas Tch. Lembut, Trv. Galur 970 ras Blc. Struktur iris (9, 10, 12) nuduhken ku sada ingan pengikat kinon bantu si terkonservasi i bas kompleks RC-LH1 (Gambar S12G). Lima UQ si terurai i bas RC-LH116 e setuju alu mehuli ras 5,8±0,7 UQ i bas tep-tep kompleks si itentuken alu kromatografi cairen berkinerja tinggi (HPLC), sedangken telu UQ si terurai i bas RC-LH114-W lebih rendah asangken Nilai si iukur i bas molekul 6,2±0,3 lit i bas Q si larut1. struktur.
Polipeptida L ras M simetris semu e masing-masing lit lima TMH ras membentuk heterodimer si menggabungken sada dimer BChl, dua monomer BChl, dua monomer bakteriofag (BPh), ras sada besi non- Heme ras sada ntah dua molekul UQ10. Arah litna ikatan hidrogen ibas gugus keton terminal ras akumulasina si enggo iteh ibas Rps, karotenoid imasukken ibas subunit M, si igelari cis-3,4-dehidroorhodopin. Jenis-jenis (25). Domain membran luar RC-H ipasang ku membran alu sada TMH. Struktur RC secara keseluruhan mirip ras telu subunit RC spesies si berhubungan (misalna Rba). si lit i bas ia (ID PDB: 3I4D). Siklus makro BChl ras BPh, tulang punggung karotenoid ras besi non-heme tumpang tindih i bas rentang resolusi struktur enda, bage pe kelompok ulu UQ10 i situs QA ras kinon QB i RC-LH116 (Gambar S15).
Ketersediaan dua struktur RC alu tingkat penghunian situs QB si berbeda mereken kesempaten si mbaru guna mereksa perubahen konformasi si konsisten si ngiringi pengikatan kinon QB. I bas kompleks RC-LH116, kinon QB lit i bas posisi “proksimal” si terikat penuh (26), tapi pemisahan RC-LH114-W la lit kinon QB. La lit kinon QB ibas RC-LH114-W, si erbahanca heran erkiteken kompleks e aktif, lebih asangken kompleks RC-LH116 si lit kinon QB si terselesaikan secara struktural. Aminna pe dua cincin LH1 e kelat kira-kira enem kinon, lima secara struktural iselesaikan i bas cincin RC-LH116 si tertutup, sedangken telu ngenca si terbatas secara struktural i bas cincin RC-LH114-W si terbuka . Gangguan struktural si meningkat enda banci ncidahken penggantian situs QB RC-LH114-W si lebih pedas, kinetika kinon si lebih pedas i bas kompleks, ras kemungkinan si meningkat ngelewati loop LH1. Kami menyaranken maka kurangna UQ i bas situs RC QB RC-LH114-W banci jadi hasil kompleks si lebih kompleks ras lebih aktif, janah situs QB RC-LH114-W enggo minter beku i bas perputaren UQ Tahap spesifik (pintu masuk ku situs QB enda enggo itutup a konformasi ref.
Adi la lit QB, rotasi si menyertai L-Phe217 ku posisi si la serasi ras pengikatan UQ10, erkiteken e pasti erbahan tabraken spasial ras unit isoprene si pemena ikur (Gambar 6A). Selain si e, perubahen konformasi utama si jelas jelas, khususna heliks de (heliks si gendek i bas loop antara TMH D ras E) i ja L-Phe217 igeser ku kantong pengikat QB ras rotasi L-Tyr223 (Gambar 6A ) Guna memutusken ikatan hidrogen entrase ras M- situs (Gambar 6B). Heliks de pivot i bas dasarna, Cα L-Ser209 bergeser 0,33Å, sedangken L-Val221Cα bergeser 3,52Å. La lit perubahen si banci iperhatiken ibas TMH D ras E, si banci itumpuk ibas duana struktur e (Gambar 6A). Sedekah si eteh, enda me struktur si pemena ibas RC alami si nutup situs QB. Perbandingen ras struktur si lengkap (QB-bound) ncidahken maka ope denga kinon e ireduksi, perlu perubahen konformasi guna erbahanca masuk ku kinon. L-Phe217 erputar guna membentuk interaksi π-stacking ras kelompok ulu kinon, janah heliks bergeser ku darat, si erbahanca rangka L-Gly222 ras rantai samping L-Tyr223 membentuk jaringan ikatan hidrogen alu struktur ikatan hidrogen si stabil (Gambar 6, A ras C).
(A) Kartun tumpang tindih hologram (rantai L, rantai oranye/M, magenta) ras struktur apo (abu-abu), i ja residu kunci itampilken i bas bentuk representasi si bagi batang. UQ10 iwakili alu sada batang si warnana kuning. Garis titik-titik ncidahken ikatan hidrogen si terbentuk i bas kerina struktur. (B ras C) Representasi permukaan apolipoprotein ras seluruh struktur cincin, menyoroti oksigen rantai samping L-Phe217 alu warna biru ras L-Tyr223 alu warna merah, masing-masing. Subunit L eme warna oranye; subunit M ras H enda erwarna. (D ras E) Situs QB RC apolipoprotein (D) ras utuh (E) [warna alu (A) masing-masing] ras Termofilus termofil PSII (hijau, biru ras kinon plastik; ID PDB: 3WU2) Sejajarken (58).
La isangka-sangka, aminna pe lit piga-piga struktur RC si kurang QB tanpa LH1, perubahen konformasi si iperhatiken i bas penelitian enda lenga pernah ilaporken sebelumna. Enda termasuk struktur kehabisen QB ibas Blc nari. (27), Tch. tepidum (ID PDB: 1Mata) (28) ras Rba. sphaeroides (PDB ID: 1OGV) (29), kerinana hampir seri ras struktur QB-na secara keseluruhan. Adi siperdiateken alu megermet 3PRC, teridah maka molekul deterjen LDAO (Lauril Dimetil Amina Oksida) terikat i bas pintu masuk posisi QB, si banci mencegah penataan kembali jadi konformasi si tertutup. Aminna pe LDAO la terurai ibas posisi si seri ibas 1EYS ntah pe 1OGV, RC enda isikapken alu make deterjen si seri emaka banci mereken efek si seri. Struktur kristal si lit bas Rba. Sphaeroides RC si bersama-sama mengkristal ras sitokrom c2 (PDB ID: 1L9B) pe tempa-tempa lit situs QB si tertutup. Tapi ibas hal enda, daerah N-terminal polipeptida RC-M (berinteraksi ras ingan pengikat QB arah ikatan H residu Tyr ibas heliks Q) mengadopsi konformasi si la alami, janah perubahen konformasi QB la i eksplorasi lebih lanjut (30 ). Si menenangkan eme lenga pernah siidah deformasi polipeptida M si bage ibas struktur RC-LH114-W, si hampir seri ras daerah N-terminal RC-LH116 RC. Perlu ka siteh kenca enggo ibasmi antena LH1 berbasis deterjen, RC apolipoprotein i bas PDB enggo terselesaikan, si menghilangkan kolam kinon internal ras lipid i bas celah antara RC ras permukaan dalam cincin LH1 si lit i sekelewetna (31, 32). RC tetap berfungsi erkiteken mempertahanken kerina kofaktor, kecuali kinon QB si banci terurai, si kurang stabil ras rusur bene ibas proses persiapen (33). Selain si e, enggo iteh maka penghapusen LH1 ras lipid siklik alami i bas RC nari banci berdampak ku fungsi, umpamana ipegendekna umur P+QB-state si terpisah muatan (31, 34, 35). Emaka, berspekulasi kami maka litna cincin LH1 lokal si ngelilingi RC banci saja mempertahanken situs QB si “tertutup”, alu bage banci mempertahanken lingkungen lokal si ndeher ras QB.
Aminna pe apolipoprotein (tanpa QB kinon) ras struktur si lengkap mewakili dua jepreten ngenca perputaren situs QB, labo serangkaian peristiwa, lit indikasi maka pengikatan banci igerbangken guna mencegah pengikatan kembali oleh hidrokinon Guna menghambat penghambatan substrat. Interaksi kinolol ras kinon i deher situs QB apolipoprotein banci berbeda, si erbahanca penolakenna RC. Enggo ndekah iusulken maka perubahen konformasi berperan ibas pengikatan ras pengurangen kinon. Kemampuan RC si beku guna ngurangi kinon kenca adaptasi gelap enggo rusak (36); Kristalografi sinar-X ncidahken maka kerusaken enda erkiteken kinon QB terjebak ibas konformasi “distal” sekitar 4,5 Å ibas posisi proksimal aktif nari (26) , 37). Kami menyaranken maka konformasi pengikat distal enda merupaken gambaren keadaan perantara antara apolipoprotein ras struktur cincin penuh, si ngikutken interaksi awal ras kinon ras pembukaan situs QB.
RC tipe II si lit ibas kompleks PSII bakteri fototrofik tertentu ras sianobakteri, ganggang ras sinuan-sinuan lit konservasi struktural ras fungsionalna (38). Penjajaren struktural si icidahken ibas gambar 6 (D ras E) menekanken kemiripen antara RC PSII ras situs QB kompleks RC bakteri. Perbandingen enda enggo ndekah jadi model guna mpelajari sistem pengikat ras reduksi kinon si erhubungen erat erkiteken si e. Publikasi sebelumna ncidahken maka perubahen konformasi isertai pengurangen PSII kinon (39, 40). Emaka adi siperdiateken konservasi evolusioner RC, mekanisme pengikat si lenga pernah iperdiateken enda banci ka berlaku man situs QB PSII RC i bas sinuan-sinuan fototrofik si beroksigen.
Rps ΔpufW (penghapusen pufW si la lit labelna) ras PufW-His (protein-W si itandaina C-terminal 10x His si iekspresiken i bas lokus pufW alami nari) strain. palustris CGA009 enggo ituriken ibas karyanta sebelumna (16). Strain enda ras induk tipe liar isogenik ibuat i bas freezer nari alu nggarisken piga-piga sel i bas PYE (masing-masing 5 g liter -1) (isimpan i bas LB i bas suhu -80 °C, si mengandung 50% ( w/v) protein gliserol, ekstrak ragi ras suksinat (% pla.]w agar [1)v5. Piring e i inkubasi semalam i bas gelap i bas suhu kamar i bas kondisi anaerobik, kenca si e iterangi alu cahaya si mbentar (~50 μmolm-2 s-1) si isediaken bohlam halogen OSRAM 116-W (RS Components, Inggris) selama 3 seh ku 5 wari seh maka muncul sada koloni. Sada koloni ipake guna inokulasi 10 ml media M22+ (41) si itambahi asam kasamino 0,1% (w/v) (selanjutna igelari M22). Kultur e ipertumbuhken ibas kondisi oksigen si rendah ibas gelap ibas suhu 34°C alu igoyang-goyang alu 180 rpm selama 48 jam, kenca si e 70 ml kultur e i inokulasi ibas kondisi si seri selama 24 jam. Kultur semi aerobik alu volume 1 ml ipake guna inokulasi 30 ml media M22 ibas botol kaca transparan universal 30 ml si lit sekrupna ras iradiasi alu agitasi (~50μmolm-2 s-1) selama 48 jam alu gaya magnet steril Batang pengaduk. Jenari 30 ml kultur e i inokulasi alu kira-kira 1 liter kultur ibas kondisi si seri, si kenca si e ipake guna inokulasi kira-kira 9 liter kultur si iterangi alu ~200 μmolm-2 s-1 selama 72 jam. Sel-sel e ipanen alu sentrifugasi i bas suhu 7132 RCF selama 30 menit, isuspensi mulihi i bas ~10 ml tris-HCl 20 mM (pH 8,0), janah isimpan i bas suhu -20°C seh iperluken.
Kenca enggo icairken, tambahken piga-piga kristal deoksiribonuklease I (Merck, Inggris), lisozim (Merck, Inggris) ras dua tablet penghambat protease holoenzim Roche (Merck, Inggris) ku sel-sel si enggo isuspensi mulihi. I bas sel tekanan Perancis si 20.000 psi (Aminco, AS), sel-sel e terganggu 8 seh ku 12 kali. Kenca enggo itangtangi sel-sel si la pecah ras puing-puing si la terlarut alu sentrifugasi i bas suhu 18.500 RCF selama 15 menit i bas suhu 4°C, membran e iendapken i bas lisaat si erpigmen alu sentrifugasi i bas suhu 113.000 RCF selama 2 jam i bas suhu 43.000°C. Buang fraksi si larut ras suspendken mulihi membran si erwarna i bas 100 seh 200 ml tris-HCl 20 mM (pH 8,0) ras homogenisasi seh lanai lit agregat si teridah. Membran si tersuspensi e i inkubasi ibas tris-HCl 20 mM (pH 8,0) (Anatrace, AS) si mengandung 2% (w/v) β-DDM selama 1 jam ibas ingan si gelap ibas suhu 4°C alu iaduk alu lembut. Jenari sentrifugasi ibas suhu 70°C guna ngelarutken 150.000 RCF ibas suhu 4°C selama 1 jam guna mbuang sisa-sisa si la terlarut.
Membran pelarut i bas galur ΔpufW nari ibahan ku kolom pertukaran ion Sepharose DEAE 50 ml alu telu volume kolom (CV) penyangga pengikat [tris-HCl 20 mM (pH 8,0) si mengandung 0,03% (w/v) β-DDM]. Cuci kolom alu dua penyangga pengikat CV, jenari cuci kolom alu dua penyangga pengikat si mengandung 50 mM NaCl. Kompleks RC-LH116 i elusi alu gradien linier 150 seh ku 300 mM NaCl (ibas penyangga pengikat) ibas 1,75 CV, janah sisa kompleks pengikat i elusi alu penyangga pengikat si mengandung 300 mM NaCl ibas 0,5 CV. Ipepulung spektrum penyerapan antara 250 ras 1000 nm, ijaga fraksi si rasio penyerapan (A880/A280) lebih asangken 1 i bas 880 seh ku 280 nm, encerken dua kali i bas penyangga pengikat, janah ipake mulihi prosedur si seri i bas kolom DEAE On pemurnian. Encerken pecahen-pecahen si rasio A880/A280 lebih 1,7 ras rasio A880/A805 lebih 3,0, lakoken putaren pertukaran ion si peteluken, ras pertahanken pecahen-pecahen si rasio A880/A280 lebih 2,2 ras rasio A880/A805 lebih 0. Kompleks si enggo imurniken sebagian e ikonsentrasiken seh ~2 ml i bas saringan sentrifugal Amicon 100.000 berat molekul (MWCO) (Merck, Inggris), janah i muat i bas kolom pengecualian ukuren Superdex 200 16/600 (GE Healthcare, AS) si mengandung penyangga NaM thelume, 1,5 CV si lit. Kumpulken spektrum penyerapan fraksi pengecualian ukuren, ras konsentrasiken spektrum penyerapan alu rasio A880/A280 lebih 2,4 ras rasio A880/A805 lebih 5,8 seh ku 100 A880, ras minter pake guna persiapen grid cryo-TEM ntah pe penyimpanan perlu unC°8.
Membran pelarut i bas galur PufW-His nari ibahan ku kolom Sefarosa HisPrep FF Ni-NTA 20 ml (tris-HCl 20 mM (pH 8,0) si mengandung NaCl 200 mM ras 0,03% (b/b)) i bas penyangga IMAC Kesehaten ( GE). v) β-DDM]. Kolom e icuci alu lima CV penyangga IMAC, kenca si e alu lima CV penyangga IMAC si mengandung histidin 10 mM. Kompleks inti i elusi ibas kolom nari alu lima penyangga IMAC si mengandung histidin 100 mM. Fraksi si lit kompleks RC-LH114-W ipekonsentrasi seh ~10 ml i bas tangki si iaduk si ilengkapi alu saringan Amicon 100.000 MWCO (Merck, Inggris), i encerken 20 kali alu penyangga pengikat, kenca si e itambahken ku 25 ml I bas penyangga DEAE b i bas lebe. Cuci kolom alu empat penyangga pengikat CV, kenca si e eluasi kompleks e i bas waluh CV i bas gradien linier 0 seh ku 100 mM NaCl (ibas penyangga pengikat), janah sisa empat CV si lit rasio penyangga pengikat 100 mM Kompleks sisa si eluasi alu natri8A20. lebih tinggi asangken 2,4 ras rasio A880/A805 lebih tinggi asangken 4,6 fraksi ikonsentrasiken seh ~2 ml i bas saringan sentrifugal Amicon 100.000 MWCO, janah iisi alu 1,5 CV IMAC i lebe-lebe Penyangga iseimbangi Superdex 200 colulum i bas penyangga 16/600. 1,5 CV si lit. Kumpulken spektrum penyerapan pecahen ukuren-pengecualian ras konsentrasiken spektrum penyerapan alu rasio A880/A280 lebih 2,1 ras rasio A880/A805 lebih 4,6 seh ku 100 A880, si minter ipake guna persiapen kisi TEM beku ntah pe isimpan i bas suhu perlu -80°C.
Igunaken sada freezer immersi Leica EM GP guna nikapken kisi-kisi TEM si suhu rendah. Kompleks e iencerkan ibas penyangga IMAC jadi A880 50, kenca si e 5μl i muat ku bas jala tembaga si ilapisi karbon QUANTIFOIL 1,2/1,3 si mbaru denga bercahaya (Agar Scientific, Inggris). Inkubasi kisi-kisi e ibas suhu 20°C ras kelembaben relatif 60% selama 30 s, kenca si e blot kering selama 3 s, kenca si e padamken ibas etan cair ibas suhu -176°C.
Data kompleks RC-LH114-W icatat i bas eBIC (Pusat Bioimaging Elektronik) (Sumber Cahaya Berlian Inggris) alu mikroskop Titan Krios, si erdahin i bas tegangan percepatan 300kV, alu perbesaran nominal Choose ga.000 a-V ras sada e. Sebuah Gatan 968 GIF Quantum si lit detektor puncak K2 ipake guna ngerekam gambar ibas mode penghitungen guna mpersada data. Ukuren piksel si ikalibrasi eme 1,048Å, janah tingkat dosisna eme 3,83 e-Å-2s-1. Ipepulungna film e i bas 11 detik janah ibagina jadi 40 bagin. Gunaken daerah si ilapisi karbon guna fokus mulihi mikroskop, kenca si e kumpulken telu film i bas sada lubang. Secara total lit 3130 film si ipepulung, alu nilai defokus antara -1 ras -3μm.
Data guna kompleks RC-LH116 ipepulung alu make mikroskop si seri i Laboratorium Biostruktur Asterbury (Universitas Leeds, Inggris). Data e ikumpulken alu mode penghitungen alu perbesaran 130 k, janah ukuren piksel ikalibrasi jadi 1,065 Å alu dosis 4,6 e-Å-2s-1. Film e i rekam i bas 12 detik janah ibagi jadi 48 bagin. Secara total lit 3359 film si ipepulung, alu nilai defokus antara -1 ras -3μm.
Kerina pengolahen data ilakoken ibas pipa Relion 3.0 (42). Gunaken Motioncorr 2 (43) guna mpehuli gerak balok alu pemboboten dosis, kenca si e gunaken CTFFIND 4.1 (44) guna nentuken parameter CTF (fungsi perpindahen kontras). Fotomikrograf khas kenca tahap pengolahen awal enda ituriken ibas gambar 2. S16. Templat pemilihen otomatis ihasilken alu milih secara manual kira-kira 250 piksel 1000 partikel i bas bingkai 250 piksel ras la lit acuan klasifikasi dua dimensi (2D), alu bage itulak klasifikasi-klasifikasi si memenuhi kontaminasi sampel ntah pe la lit karakteristik si banci idah. Jenari, ilakoken pemilihen otomatis ku kerina mikrofoto, janah RC-LH114-W lit 849.359 partikel, janah kompleks RC-LH116 lit 476.547 partikel. Kerina partikel si ipilih enggo menjalani dua putaren klasifikasi 2D non-referensi, janah kenca tiap lari, partikel si jumpa ras luas karbon, kontaminasi sampel, la lit fitur si jelas ntah pe partikel si tumpang tindih si megegeh itulak, si erbahanca 772.033 (90,9%) ras 359.657% klasifikasi guna3D RC-LH114-W ras RC-LH116 masing-masing. Model acuan 3D awal ihasilken alu make metode keturunen gradien stokastik. Alu make model awal jadi acuan, partikel-partikel si ipilih ibagi jadi empat kategori i bas 3D. Alu make model ibas kategori enda jadi acuan, ilakoken pemurnian 3D nandangi partikel-partikel ibas kategori si mbelinna, kenca si e ipake filter low-pass 15Å awal guna nutupi daerah pelarut, tambahi 6 piksel tepi si lembut, ras pasca-proses piksel-piksel e guna memperbaiki fungsi transfer Gatan K2 puncak puncak Mo. Bagi dataset RC-LH114-W, model awal enda imodifikasi alu mbuang kepadaten si megegeh i tepi-tepi topeng (terputus hubungenna ras kepadaten kompleks inti i bas UCSF Chimera). Model si ihasilken (resolusi RC-LH114-W ras RC-LH116 masing-masing 3,91 ras 4,16 Å) ipake jadi acuan guna putaren klasifikasi 3D si peduaken. Partikel-partikel si ipake ikelompokken ku bas kelas 3D awal ras la lit korelasi si megegeh ras lingkungen. Tumpang tindih ntah pe kurangna fitur struktural si jelas. Kenca dung putaren klasifikasi 3D si peduaken, ipilih me kategori si lit resolusina si meganjangna [Bagi RC-LH114-W, sada kategori eme 377.703 partikel (44,5%), bagi RC-LH116, lit dua kategori saja, totalna 260.752 partikel eme W (i jenda) si sejajar. kenca rotasi awal alu perbedan si kitik]. Partikel-partikel si ipilih e i ekstraksi mulihi i bas kotak si belangna 400 piksel janah iperbaiki alu pemurnian 3D. Masker pelarut e ihasilken alu make filter low-pass 15Å awal, ekspansi peta 3 piksel ras masker lembut 3 piksel. Alu make pemurnian CTF per partikel, koreksi gerak per partikel ras putaren peduaken pemurnian CTF per partikel, pemurnian 3D, penyamaran pelarut ras pasca pengolahen ilakoken kenca tiap langkah guna lebih mperbaiki tekstur si ihasilken. Alu make nilai cut-off FSC (Koefisien Korelasi Cangkang Fourier) 0,143, maka resolusi model akhir RC-LH114-W ras RC-LH116 masing-masing 2,65 ras 2,80Å. Kurva FSC model si terakhir teridah ibas gambar 2. S17.
Kerina uruten protein iunduh i bas UniProtKB: LH1-β (PufB; ID UniProt: Q6N9L5); LH1-α (PufA; Sada ProtID: Q6N9L4); RC-L (PufL; ID UniProt: O83005); RC-M (PufM; ID UniProt: A0A4Z7); RC-H (PuhA; ID UniProt: A0A4Z9); Protein-W (PufW; ID UniProt: Q6N1K3). SWISS-MODEL (45) ipake guna membangun model homologi RC, si isina uruten protein RC-L, RC-M ras RC-H bagepe struktur kristal Rba. RC si ipake jadi cetakan (ID PDB: 5LSE) (46). Gunaken alat “peta pas” i bas Chimera UCSF guna cocokken model si ihasilken ras peta (47), mpehuli struktur protein, ras kofaktor [4×BChl a (nama residu perpustakaan monomer = BCL), 2×BPh a (BPH), sada ntah dua jenis UQ10 (U10), sada non-heron ras sada non-heron 3,4-dihidroheksakarbonilkolin (QAK)] pake Coot (48) guna nambahi. Erkiteken QAK la lit ibas perpustakaan monomer, maka iparameterken alu make alat eLBOW ibas PHENIX (49).
Selanjutna, ibahan me subunit LH1. Awalna, alat konstruksi otomatis i bas PHENIX (49) ipake guna otomatis membangun bagin uruten LH1 alu make peta ras uruten protein LH1-α ras LH1-β jadi masuken. Pilih subunit LH1 si paling lengkap, ekstrak ras muat ku Coot, secara manual tambahi uruten si kurang i bas ia, ras secara manual perbaiki kerina struktur ope denga itambahken dua BCls a (BCL) ras sada spirilloxanthin (CRT) [menurut Rps si bersangkutan Kepadaten kompleks LH1 ras kandungan karotenoid si enggo iteh. Jenis-jenis (17)]. Salin subunit LH1 si lengkap, janah pake “Alat Peta Dok” Chimera UCSF guna berlabuh i daerah non-model si berdekatan si lit kepadaten LH1, jenari perbaiki i Coot; ulangi prosesna seh kerina subunit LH1 enggo imodelen. Bagi struktur RC-LH114-W, alu mengekstrak kepadaten si la ialokasiken i bas Coot, protein e ibagi-bagi i bas komponen non-protein si tading i bas peta Chimera USCF ras alat Autobuild ipake guna menetapken model awal, ras subunit si tading (protein-W) Pemodelen. I bas PENIS (49). Tambahken uruten si kurang ku model si ihasilken i bas Coot (48), kenca si e perbaiki secara manual kerina subunit. Kepadaten si la ialokasiken si tading cocok ras kombinasi lipid (ID perpustakaan monomer PDB CDL = CDL, POPC = 6PL ras POPG = PGT), deterjen β-DDM (LMT) ras molekul UQ10 (U10). Gunakenlah optimasi PHENIX (49) ras optimasi manual i bas Coot (48) guna menyempurnaken model awal si lengkap seh maka statistik model ras kualitas visual si pas la banci lebih itingkatken. Si terakhir, pake LocScale (50) guna ngasah peta lokal, kenca si e ilakoken piga-piga siklus si deban pemodelen kepadaten si la ialokasiken ras optimasi otomatis ras manual.
Peptida, kofaktor ras lipid ras kinon si deban si berlabuh i bas kepadatenna masing-masing ituriken i bas Gambar 1 ras 2. S18 seh ku S23. Informasi statistik model si terakhir ituriken ibas Tabel S1.
Adi la lit si itentuken, spektrum penyerapan UV/Vis/NIR ikumpulken i bas spektrofotometer Cary60 (Agilent, AS) alu jarak 1 nm mulai 250 nm seh ku 1000 nm ras waktu integrasi 0,1s.
Encerken sampel ibas kuvet kuarsa alu jalur 2 mm ku A880 ibas 1, ras kumpulken spektrum penyerapan antara 400 ras 1000 nm. Spektrum dikroik si melingkar e ikumpulken alu spektropolarimeter Jasco 810 (Jasco, Jepang) alu jarak 1 nm antara 400 nm ras 950 nm alu kecepatan pindai 20 nm min-1.
Koefisien kepunahen molar itentuken alu encerkan kompleks inti ku A880 kurang lebih 50. Encerken volume 10μl ibas penyangga pengikat ntah pe metanol 990μl, ras kumpulken spektrum penyerapan segera guna meminimalken degradasi BChl. Kandungan BChl ibas tep-tep sampel metanol ihitung alu koefisien kepunahen ibas 771 nm 54,8 mM-1 cm-1, janah koefisien kepunahen itentuken (51). Bagiken konsentrasi BChl si iukur alu 32 (RC-LH114-W) ntah pe 36 (RC-LH116) guna nentuken konsentrasi kompleks inti, si kenca si e ipake guna nentuken spektrum penyerapan sampel si seri si ipepulung i bas penyangga Koefisien Kepunahen. paralel. Telu kali pengukuren si iulang-ulang ibahan guna tiap sampel, janah rata-rata absorbansi maksimum BChl Qy ipake guna perhitungen. Koefisien kepunahen RC-LH114-W si iukur ibas 878 nm eme 3280±140 mM-1 cm-1, sedangken koefisien kepunahen RC-LH116 si iukur ibas 880 nm eme 3800±30 mM-1 cm-1.
UQ10 iukur rikutken metode si lit ibas (52). Singkatna, HPLC fase terbalik (RP-HPLC) ilakoken alu make sistem HPLC Agilent 1200. Larutken kira-kira 0,02 nmol RC-LH116 ntah pe RC-LH114-W i bas 50μl metanol:kloroform 50:50 si mengandung 0,02% (b/v) klorida besi, janah suntikken laruten Beckman Coulter si enggo iseimbangken lebe i bas m6 m4 Ultrasfer ODS-1. 40°C ibas pelarut HPLC (80:20 metanol:2-propanol) ibas kolom ×25 cm. Ilakoken elusi isokratik ibas pelarut HPLC guna memantau penyerapan ibas 275 nm (UQ10), 450 nm (karotenoid) ras 780 nm (BChl) selama 1 jam. Puncak ibas kromatogram 275 nm ibas 25,5 menit i terintegrasi, si la lit senyawa si deban si banci ideteksi. Daerah si terintegrasi ipake guna ngitung jumlah molar UQ10 si iekstraksi alu mengacu ku kurva kalibrasi si ihitung arah injeksi standar murni mulai 0 seh ku 5,8 nmol (Gambar S14). Tiap sampel i analisis ibas telu kali ulangen, janah kesalahan si ilaporken sesuai ras SD rata-rata.
Larutan si mengandung kompleks RC-LH1 alu penyerapan Qy maksimal 0,1 isikapken alu 30 μM sitokrom jantung kuda si ireduksi c2 (Merck, Inggris) ras 0 seh ku 50 μMUQ2 (Merck, Inggris). Telu sampel 1-ml isikapken ibas tiap konsentrasi UQ2 ras iinkubasi semalam ibas gelap ibas suhu 4°C guna memastikan adaptasi lengkap ku gelap ope denga iukur. Larutan e i muat ku bas spektrofotometer modular OLIS RSM1000 si ilengkapi alu kisi-kisi api/500 garis 300 nm, celah masuk 1,24 mm, celah tengah 0,12 mm ras celah keluar 0,6 mm. Filter pass si gedangna 600 nm itamaken i bas pintu masuk fototabung sampel ras tabung fotomultiplier acuan guna ngelukai cahaya eksitasi. Absorbansi e i pantau ibas 550 nm alu waktu integrasi 0,15 s. Cahaya eksitasi e ipancarken arah LED M880F2 (Dioda Pemancar Cahaya) 880 nm (Thorlabs Ltd., Inggris) arah kabel serat optik si intensitasna 90% arah kontroler DC2200 (Thorlabs Ltd., Inggris) ras ipancarken ku sumber cahaya si sudut90°. Balok pengukuren e ilawan ras cermin guna mulihken terang kai pe si tangtangna la iserap sampel e. Pantau absorbansi 10 s ope denga penerangan 50 s. Jenari absorbansi e ipantau lebih lanjut selama 60 s ibas gelap guna menilai sejauh kai kinolol secara spontan mengurangi sitokrom c23 + (nen Gambar S8 guna data mentah).
Data e iproses alu cocokken laju awal linier i bas 0,5 seh 10 s (tergantung konsentrasi UQ2) ras rata-rata laju i bas teluna sampel i bas tep-tep konsentrasi UQ2. Konsentrasi RC-LH1 si ihitung alu koefisien kepunahen masing-masing ipake guna ngubah laju jadi efisiensi katalitik, i plot i bas Origin Pro 2019 (OriginLab, AS), ras ipasang ku model Michaelis-Menten guna nentuken nilai Km ras Kcat si teridah.
Guna pengukuren penyerapan sementara, sampel RC-LH1 i encerken seh ~2μM ibas penyangga IMAC si mengandung 50 mM natrium askorbat (Merck, AS) ras 0,4 mM Terbutin (Merck, AS). Asam askorbat ipake sebage donor elektron pengorbanen, ras tert-butaclofen ipake sebage penghambat QB guna memastikan donor RC utama tetap berkurang (ertina, la fotooksidasi) sepanjang proses pengukuren. Kurang lebih 3 ml sampel itambahken ku sel si erputar khusus (diameterna kira-kira 0,1 m, 350 RPM) alu gedang jalur optik 2 mm guna memastikan sampel i bas jalur laser lit waktuna si cukup guna adaptasi gelap antara pulsa eksitasi. Gunaken pulsa laser ~100-fs guna mpegegehi sistem laser Ti: Safir (Fisika Spektra, AS) guna menggairahken sampel i bas 880 nm alu kecepatan pengulangan 1 kHz (20 nJ guna NIR ntah pe 100 nJ guna Vis). Sope ipepulung data, itamaken lebe sampel e ku cahaya eksitasi kira-kira 30 menit. Paparen e erbahanca QA inaktif (mungkin mengurangi QA sekali ntah dua kali). Tapi perlu siteh proses enda reversibel erkiteken kenca ndekah masa adaptasi si gelap, RC pe lambat laun mulihken ku kegiaten QA. Spektrometer Helios (Sistem Ultracepat, AS) ipake guna ngukur spektrum si sementara alu waktu penundaan -10 seh ku 7000 ps . Pakelah perangkat lunak Surface Xplorer (Sistem Ultrafast, AS) guna ngelepasken kelompok data e, kenca si e igabungken ras ibakuken. Gunaken paket perangkat lunak CarpetView (Light Conversion Ltd., Lituania) guna makeken kumpulen data si igabungken guna ndatken spektrum diferensial si lit hubungenna ras peluruhan, ntah pe gunaken fungsi si ngelibatken piga-piga eksponen alu respon instrumen gelah cocok ras evolusi spektral panjang gelombang tunggalb i Origin, ASLa).
Bagi si enggo ituriken ndai (53), isikapken film fotosintesis si mengandung kompleks LH1 si kurang antena RC bagepe antena LH2 perifer. Membran e i encerken ibas tris 20 mM (pH 8,0) kenca e i muat ku bas kuvet kuarsa si jalur optikna 2 mm. Pulsa laser 30nJ ipake guna menggairahken sampel ibas 540 nm alu waktu penundaan -10 seh ku 7000 ps. Olah kumpulen data bagi si enggo ituriken guna Rps. pal contohna.
Membran e ipelet alu sentrifugasi 150.000 RCF selama 2 jam i bas suhu 4°C, kenca si e absorbansina i bas 880 nm isuspensi mulihi i bas tris-HCl 20 mM (pH 8,0) ras NaCl 200 mM. Larutken membran alu iaduk alu manjar-anjar ibas 2% (w/v) β-DDM selama 1 jam ibas ingan si gelap ibas suhu 4°C. Sampel e iencerkan ibas 100 mM trietilamonium karbonat (pH 8,0) (TEAB; Merck, Inggris) seh ku konsentrasi protein 2,5 mg ml-1 (analisis Bio-Rad). Pengolahen selanjutna ilakoken arah metode si enggo iterbitken sebelumna (54), ibenaken alu pengenceren 50 μg protein jadi total 50 μl TEAB si mengandung 1% (w/v) natrium laurat (Merck, Inggris). Kenca sonikasi 60 s, i reduksi alu tris(2-karboksietil)fosfin (Merck, Inggris) 5 mM i bas suhu 37°C selama 30 menit. Guna S-alkilasi, inkubasi sampel alu metil S-metiltiometansulfonat 10 mM (Merck, Inggris) ras itambahken arah larutan stok isopropanol 200 mM selama 10 menit ibas suhu kamar. Pencernaan proteolitik ilakoken alu nambahi 2 μg campuren tripsin/endoproteinase Lys-C (Promega UK) ras iinkubasi ibas suhu 37°C selama 3 jam. Surfaktan laurate i ekstraksi alu nambahi 50 μl etil asetat ras 10 μl asam trifluoroasetat (TFA; Thermo Fisher Scientific, Inggris) kelas LC 10% (v/v) ras i vortex selama 60 s. Pemisahan fase e ipromosiken alu sentrifugasi ibas 15.700 RCF selama 5 menit. Rikutken protokol pabrik, kolom spin C18 (Thermo Fisher Scientific, Inggris) ipake guna mengaspirasi ras menghapus garam fase si arah teruh si lit peptida e alu megermet. Kenca enggo ikeringken alu sentrifugasi vakum, sampel ilarutken ibas TFA 0,5% ras asetonitril 3%, janah 500 ng ianalisis alu kromatografi RP nanoflow si itambahi alu spektrometri massa alu make parameter sistem si enggo i rinciken sebelumna.
Gunaken MaxQuant v.1.5.3.30 (56) guna identifikasi ras kuantifikasi protein guna ndarami Rps. i bas sada paksa, lit sekalak dilaki si gelarna palustris. Data proteomik spektrometri massa enggo isimpan i bas Aliansi Pertukaran Proteome arah gudang mitra PRIDE (http) i teruh pengidentifikasi dataset PXD020402.
Guna analisis alu RPLC si itambahi alu spektrometri massa ionisasi elektrospray, kompleks RC-LH1 isikapken arah Rps tipe liar. Alu make metode si enggo iterbitken sebelumna (16), konsentrasi protein si ihasilken ibas sel palustris eme 2 mg ml-1 ibas Hepes 20 mM (pH 7,8), NaCl 100 mM ras 0,03% (b/v) β- (analisis Bio-Rad) ) DDM. Rikutken protokol pabrik, pakelah alat pemurnian 2D (GE Healthcare, AS) guna ndatken 10 μg protein alu cara pengendapen, ras larutken endapen e i bas 20 μl asam formik (FA) 60% (v/v), 20% (v/v) Asetonitril/vvter 20%. Lima mikroliter i analisis alu RPLC (Dionex RSLC) si itambahi alu spektrometri massa (Maxis UHR-TOF, Bruker). Gunaken kolom MabPac 1,2×100 mm (Thermo Fisher Scientific, Inggris) guna pemisahan i bas suhu 60°C ras 100μlmin -1, alu gradien 85% (v/v) pelarut A [0,1% (v/v) pelarut FA ras 0,02% (v/v) larutan BFA/v a5. [0,1%(v/v) FA ras 0,02%(v/v) ibas TFA asetonitril 90%(v/v)] Alu make sumber ionisasi elektrosemprot standar ras parameter bawaan lebih 60 menit, spektrometer massa ndatken 100 seh ku 2750 m/z (rasio massa-ke-muatan). Alu penampat portal sumber daya bioinformatika ExPASy alat FindPept (https://web.expasy.org/findpept/), petaken spektrum massa ku subunit-subunit kompleks e.
Sel-sel e ipebelin 72 jam i teruh cahaya 100 ml NF-rendah (10μMm-2 s-1), menengah (30μMm-2 s-1) ntah pe tinggi (300μMm-2 s-1). Media M22 (media M22 i ja amonium sulfat ihilangkan ras natrium suksinat igantiken alu natrium asetat) i bas botol sekrup 100 ml (23). I bas lima siklus 30-s, manik-manik kaca 0,1 mikron i manik-manikken alu rasio volume 1:1 guna ngelisis sel-sel ras i dinginken i datas es selama 5 menit. Bahan si la terlarut, sel si la pecah ras manik-manik kaca ibuat alu sentrifugasi i bas 16.000 RCF selama 10 menit i bas mikrosentrifugasi bangku. Membran e ipisahken ibas rotor Ti 70,1 alu 100.000 RCF ibas tris-HCl 20 mM (pH 8,0) alu gradien sukrosa 40/15% (b/b) selama 10 jam.
Bagi si enggo ituriken ibas karyanta sebelumna, imunodeteksi tag His ibas PufW (16). Singkatna, kompleks inti si enggo imurniken (11,8 nM) ntah pe membran si mengandung konsentrasi RC si seri (itentuken alu oksidasi si ngkurangi spektrum perbedan si berkurang ras cocokken beban i bas gel si enggo iwarnai) i bas penyangga pemuatan SDS 2x (Merck, Inggris) i encerken dua kali. Protein-protein e ipisahken i bas replika gel NuPage bis-tris 12% (Thermo Fisher Ilmiah, Inggris). Sada gel iwarnai alu Biru Cemerlang Coomassie (Bio-Rad, Inggris) guna muat ras memvisualisasiken subunit RC-L. Protein si lit bas gel si peduaken ipindahken ku membran poliviniliden fluorida (PVDF) si iaktifken metanol (Thermo Fisher Scientific, Inggris) guna imunoassay. Membran PVDF iblokir i bas tris-HCl 50 mM (pH 7,6), NaCl 150 mM, susu bubuk skim Tween-20 0,2% (v/v) ras 5% (b/v), kenca si e iinkubasi alu antibodi primer anti-His (ibas penyangga tris-HCl m0l 7,6), NaCl 150 mM ras 0,05% (v/v) Tween-20] i bas 1:1000 A190-114A, Laboratorium Betil, AS) selama 4 jam. Kenca enggo icuci 3 kali selama 5 menit i bas penyangga antibodi, membran e igabungken ras antibodi sekunder anti-tikus lobak peroksidase (Sigma-Aldrich, Inggris) (encerkan 1:10.000 i bas penyangga antibodi) Winkubasi gelah banci deteksi (5 menit kenca 3 kali icuci i bas penyangga antibodi kemistrat CAR0). (Sianagen, Italia) ras Pencitraan Amersham 600 (Perawatan Kesehatan GE, Inggris).
Alu nggambarken persebaran intensitas tep-tep jalur gel si iwarnai ntah pe imunoassay, mengintegrasiken daerah i teruh puncak ras ngitung rasio intensitas RC-L (gel si iwarnai) ras Protein-W (imunoassay), i bas GambarJ (57) Olah gambar. Rasio-rasio enda iubah jadi rasio molar alu mengasumsiken maka rasio RC-L ras protein-W ibas sampel RC-LH114-W murni eme 1:1 ras normalisasi kerina kumpulen data si sesuai.
Guna bahan tambahen guna artikel enda, banci idahndu i bas http://advances.sciencemag.org/cgi/isi/lengkap/7/3/eabe2631/DC1.
Enda me sada artikel akses terbuka si ibagiken alu ketentuan Lisensi Atribusi Creative Commons. Artikel enda banci ipake, ibagiken, ras ireproduksi alu la terbatas i bas media kai pe alu syarat karya aslina ikutipna alu payo.
Cataten: Kami hanya mindo gelah iberekenndu alamat emailndu gelah kalak si irekomendasikenndu ku halaman e meteh maka atendu idahna email e janah labo spam. Labo itangkap kami alamat email si lit.
Penungkunen enda ipake guna nguji kam pengunjung ntah lang ras mencegah pengirimen spam otomatis.
10:10, 11. 10 I bas sada paksa, lit piga-piga kalak si gelarna Dariusz M. Niedzwiedzki, Elizabeth C. Martin, Daud A. Farmer, Lorna A. Malone, Rebecca F. Thompson, Neil A. Ranson, Daniel P Canniffe , Mark J.
Struktur resolusi tinggi kompleks perangkap cahaya 1 i bas pusat reaksi mereken wawasen si mbaru kerna dinamika kinon.
10:10, 11. 10 I bas sada paksa, lit piga-piga kalak si gelarna Dariusz M. Niedzwiedzki, Elizabeth C. Martin, Daud A. Farmer, Lorna A. Malone, Rebecca F. Thompson, Neil A. Ranson, Daniel P Canniffe , Mark J.
Struktur resolusi tinggi kompleks perangkap cahaya 1 i bas pusat reaksi mereken wawasen si mbaru kerna dinamika kinon.
©2021 Asosiasi Amerika guna Kemajun Ilmu Pengetahuan. kerina hak cipta lit i bas ia. AAAS eme mitra HINARI, AGORA, OARE, KOOR, JAMSS, Ref Silang ras PENGHITUNG. Kemajun Ilmu Pengetahuan ISSN 2375-2548.