Hadir *Alamat si genduari: Köln 50931, Jerman, Penelitian Klaster Keunggulen Köln kerna Respon Stres Seluler i bas Penyakit si Erkaiten ras Penuaan (CECAD).
Neurodegenerasi pinakit mitokondria ianggap la banci ibalikken erkiteken plastisitas metabolisme neuron terbatas, tapi pengaruh disfungsi mitokondria nandangi otonomi sel metabolisme neuron i bas kula kurang ipahami. Ijenda, ipetandaken kami proteom spesifik sel neuron Purkinje si lit defisiensi OXPHOS si progresif si erkiteken dinamika fusi mitokondria si terganggu. Ijumpai kami maka disfungsi mitokondria memicu perubahen si mbages i bas bidang proteomik, si dungna erbahanca terjadi aktivasi beruruten program metabolisme si tepat ope denga sel mate. La isangka-sangka, itentuken kami induksi si jelas piruvat karboksilase (PCx) ras enzim anti penuaan si deban si melengkapi perantara siklus TCA. Penghambaten PCx mpeburuk stres oksidatif ras neurodegenerasi, si ncidahken maka aterosklerosis lit efek perlindungenna i bas neuron si kurang OXPHOS. Pemulihen fusi mitokondria ibas neuron si enggo degeneratif secara terminal benar-benar membalikken karakteristik metabolisme enda, alu bage mencegah kematen sel. Temuen kami ngidentifikasi jalur si lenga pernah iteh si mereken ketahanan nandangi disfungsi mitokondria ras ncidahken maka neurodegenerasi banci ibalikken aminna pe i bas tahap akhir pinakit e.
Peran sentral mitokondria ibas njaga metabolisme energi neuron itekanken alu gejala-gejala saraf si meluas si lit hubungenna ras pinakit mitokondria manusia. Melala pinakit enda erkiteken mutasi gen si ngaturken ekspresi gen mitokondria (1, 2) ntah pe kehancuren gen si berhubungen ras dinamika mitokondria, si secara la langsung mpengaruhi stabilitas DNA mitokondria (mtDNA) (3, 4). Kerja i bas model binatang enggo ncidahken maka i bas merespon disfungsi mitokondria i bas jaringan sekitarna, jalur metabolisme konservatif (5-7) banci iaktifken, si mereken informasi si penting guna pemahamen si mbages kerna patogenesis pinakit-pinakit si kompleks enda. Sebalikna, pemahamennta kerna perubahen metabolisme jenis sel tertentu si erkiteken kegagalan umum produksi adenosin trifosfat (ATP) mitokondria otak e mendasar (8), si menekanken perluna ngidentifikasi target terapi si banci ipake guna mencegah ntah pe mencegah pinakit. Mencegah degenerasi saraf (9). Kurangna informasi eme kenyataan maka sel saraf secara luas ianggap memiliki fleksibilitas metabolisme si sangat terbatas adi ibandingken ras jenis sel jaringan sekitarna (10). Inget maka sel-sel enda berperan sentral ibas mengkoordinasiken pasoken metabolit ku neuron guna mendorong transmisi sinaptik ras merespon kondisi luka ras pinakit, maka kemampuan guna menyesuaiken metabolisme sel ku kondisi jaringan otak si menantang hampir terbatas ku sel glial (11-14). Selain si e, heterogenitas seluler si melekat i bas jaringan otak sebagian besar menghambat penelitian kerna perubahen metabolisme si terjadi i bas subkelompok neuron tertentu. Akibatna, la mbue si iteh kerna konsekuensi seluler ras metabolisme si tepat i bas disfungsi mitokondria i bas neuron.
Guna ngangkai konsekuensi metabolisme disfungsi mitokondria, isolasi kami neuron Purkinje (PN) ibas tahap neurodegenerasi si berbeda si isebabken kehancuren fusi membran luar mitokondria (Mfn2). Aminna pe mutasi Mfn2 i bas manusia ihubungken ras bentuk neuropati sensorik motorik keturunan si itandai sebage Charcot-Marie-Tooth tipe 2A (15), penghancuren kondisional Mfn2 i bas tikus eme induksi disfungsi oksidasi Fosforilasi (OXthoPHOS) si iakui alu mehuli. Erbage subtipe saraf (16-19) ras fenotipe neurodegeneratif si ihasilken isertai gejala saraf si progresif, misalna gangguan gerak (18, 19) ntah pe ataksia otak kecil (16). Alu make kombinasi proteomik kuantitatif bebas label (LFQ), metabolomik, pencitraan, ras metode virologis, icidahken kami maka neurodegenerasi progresif megegeh menginduksi piruvat karboksilase (PCx) ras faktor-faktor si deban si terlibat i bas arteriosklerosis PN in vivo Ekspresi enzim. Guna memverifikasi relevansi penemuan enda, kami secara khusus down-regulate ekspresi PCx i bas PN si kurang Mfn2, janah idat kami maka operasi enda mpeberat stres oksidatif ras mempercepat neurodegenerasi, alu bage membuktiken maka azoospermia mereken kematen sel Kemampuan beradaptasi metabolisme. Ekspresi MFN2 si parah banci sepenuhna menyelamatken degenerasi terminal PN alu defisiensi OXPHOS si parah, konsumsi DNA mitokondria si mbelin, ras teridah jaringan mitokondria si rusak, si lebih menekanken maka bentuk neurodegenerasi enda bahkan banci pulih i bas tahap lanjuten pinakit sel tahun 1990-en.
Guna memvisualisasiken mitokondria i bas PN knockout Mfn2, kami make galur tikus si memungkinken mitokondria si bergantung man Cre guna menargetkan ekspresi protein fluoresen kuning (YFP) (mtYFP) (20) Cre ras iperiksa morfologi mitokondria in vivo. Ijumpai kami maka kehancuren gen Mfn2 i bas PNs banci erbahanca terjadi pembagin jaringan mitokondria secara bertahap (Gambar S1A), janah perubahen si pemena idatken i bas umur 3 minggu. Sebalikna, degenerasi substansial lapisen sel PN, bagi si ibuktikan alu hilangna imunostaining Calbindin, la mulai seh umur 12 minggu (Gambar 1, A ras B). Ketidakcocoken waktu antara perubahen morfologi mitokondria si pemena ras mulaina kematen neuron si teridah mendorong kami guna menyelidiki perubahen metabolisme si ipicu disfungsi mitokondria ope kematen sel. Ibahan kami sada strategi berbasis penyortiren sel si iaktifken alu fluoresensi (FACS) guna mengisolasi PN si mengekspresiken YFP (YFP+) (Gambar 1C), ras i bas tikus kontrol (Mfn2 + / loxP :: mtYFP loxP- stop-loxP: : L7-cre), si selanjutna igelari CT1BRL (Gambar). Optimalisasi strategi gating erpalasken intensitas relatif sinyal YFP banci erbahanca kita banci mbersihken badan YFP+ (YFPhigh) PN i bas non-PN (YFPneg) (Gambar S1B) ntah pe fragmen akson/dendritik si ianggap berpendar (YFPlow; gambar S1D, kiri). Guna memverifikasi identitas populasi si terklasifikasi, ilakoken kami proteomik LFQ kenca si e analisis komponen utama, janah idat kami lit pemisahan si jelas antara sel YFPhigh ras YFPneg (Gambar S1C). Sel YFPhigh ncidahken pengayaan bersih penanda PNs si enggo iteh (yaitu Calb1, Pcp2, Grid2 ras Itpr3) (21, 22), tapi la lit pengayaan protein si biasa iekspresiken i bas neuron ntah pe jenis sel si deban (Gambar 1D) ). Perbandingen antara sampel ibas sel YFPhigh si terklasifikasi si ipepulung ibas percobaan independen ncidahken koefisien korelasi> 0,9, ncidahken reproduksi si mehuli antara replika biologis (Gambar S1E). Singkatna, data enda memvalidasi rencana kami guna isolasi akut ras spesifik PN si layak. Erkiteken sistem penggerak L7-cre si ipake menginduksi rekombinasi mosaik ibas minggu pertama kenca persalinen (23), mulai me kami munuh tikus ibas CTRL nari ras bersyarat (Mfn2 loxP/loxP :: mtYFP loxP-stop-loxP :: L7-cre) Ngumpulken neuron. Kenca dung rekombinasi, igelari Mfn2cKO ibas umur 4 minggu. Sebage titik akhir, ipilih kami umur 8 minggu sanga lapisen PN utuh aminna pe jelas fragmentasi mitokondria (Gambar 1B ras Gambar S1A). Secara total, iukur kami total 3013 protein, si kira-kira 22% erpalasken anotasi MitoCarta 2.0 erpalasken proteom mitokondria sebage mitokondria (Gambar 1E) (Gambar 1E) (24). Analisis ekspresi gen diferensial si ilakoken i bas minggu 8 ncidahken maka 10,5% ngenca i bas kerina protein si lit perubahenna si signifikan (Gambar 1F ras Gambar S1F), i ja 195 protein si iaturken ku teruh ras 120 protein si iaturken ku datas (Gambar 1F). Perlu siteh maka “analisis jalur inovatif” ibas kumpulen data enda ncidahken maka gen si iekspresiken secara berbeda terutama termasuk ibas kumpulen jalur metabolisme tertentu si terbatas (Gambar 1G). Si menarikna, aminna pe downregulasi jalur si berhubungen ras OXPHOS ras pensinyalan kalsium menegasken induksi disfungsi mitokondria i bas PN si kurang fusi, kategori si deban si terutama melibatken metabolisme asam amino secara signifikan iatur ku datas, si sejalan ras metabolisme si terjadi i bas P kondrial mitokondria. la erfungsi.
(A) Foto konfokal perwakilen bagin otak kecil tikus CTRL ras Mfn2cKO si ncidahken kehilangan PN si progresif (calbindin, abu-abu); inti si ilawan alu DAPI. (B) Kuantifikasi (A) (analisis varians searah, ***P<0,001; n = 4 seh 6 lingkaran ibas telu tikus nari). (C) Alur kerja si ibahan alu percobaan. (D) Persebaran peta panas penanda khusus Purkinje (atas) ras jenis sel si deban (tengah). (E) Diagram Venn si ncidahken jumlah protein mitokondria si iidentifikasi i bas PN si terklasifikasi. (F) Plot gunung berapi protein si iekspresiken secara berbeda i bas neuron Mfn2cKO i bas 8 minggu (nilai cut-off signifikansi 1,3). (G) Analisis jalur kreativitas ncidahken lima jalur regulasi naik (merah) ras regulasi turun (biru) si pentingna i bas PN Mfn2cKO si iklasifikasiken 8 minggu. Rata-rata tingkat ekspresi tiap protein si terdeteksi ituriken. Peta panas skala abu-abu : nilai P si isesuaiken. ns, labo penting.
Data proteomik ncidahken maka ekspresi protein kompleks I, III, ras IV alu manjar-anjar nurun. Kompleks I, III, ras IV kerina lit subunit si esensial si ikodeken mtDNA, sedangken kompleks II si hanya ikodeken inti, pada dasarna la terpengaruh (Gambar 2A ras Gambar S2A). . Sesuai ras hasil proteomik, imunohistokimia bagian jaringan otak kecil ncidahken maka tingkat subunit MTCO1 (subunit sitokrom C oksidase mitokondria 1) kompleks IV i bas PN bertahap nurun (Gambar 2B). Subunit Mtatp8 si ikodeken mtDNA berkurang secara signifikan (Gambar S2A), sedangken tingkat steady-state subunit ATP sintase si ikodeken inti tetap la berubah, si konsisten ras kompleks F1 subassembly ATP sintase stabil si enggo iteh sanga ekspresi mtDNA stabil. Pembentukenna pe konsisten. Mengganggu (7). Evaluasi kadar mtDNA ibas PN Mfn2cKO si iurutken alu reaksi berantai polimerase waktu nyata (qPCR) menegasken penurunan jumlah salinen mtDNA secara bertahap. Adi ibandingken ras kelompok kontrol, ibas umur 8 minggu, sekitar 20% ngenca kadar mtDNA Was si ipertahanken (Gambar 2C). Konsisten ras hasil enda, pewarnaan mikroskopi konfokal PN Mfn2cKO ipake guna mendeteksi DNA, ncidahken konsumsi nukleotida mitokondria si bergantung ku waktu (Gambar 2D). Ijumpai kami maka piga-piga kandidat si terlibat i bas degradasi protein mitokondria ras respon stres ngenca si iaturken ku datas, termasuk Lonp1, Afg3l2 ras Clpx, ras faktor perakiten kompleks OXPHOS. La lit perubahen si signifikan ibas kadar protein si terlibat ibas apoptosis si terdeteksi (Gambar S2B). Bagepe idat kami maka mitokondria ras saluren retikulum endoplasma si terlibat ibas transportasi kalsium hanya lit perubahen si kitik (Gambar S2C). Selain si e, evaluasi protein si berhubungan ras autofagi la lit idat perubahen si signifikan, si konsisten ras induksi autofagosom si teridah si iperhatiken in vivo alu imunohistokimia ras mikroskopi elektron (Gambar S3). Tapi, disfungsi OXPHOS si progresif i bas PN isertai perubahen mitokondria ultrastruktur si jelas. Gugus mitokondria banci siidah ibas badan sel ras batang dendritik PN Mfn2cKO si umurna 5 ras 8 minggu, janah struktur membran dalam enggo mengalami perubahen si mbages (Gambar S4, A ras B). Konsisten ras perubahen ultrastruktur enda ras penurunen mtDNA si signifikan, analisis irisen otak otak akut alu tetrametilrodamin metil ester (TMRM) ncidahken maka potensi membran mitokondria i bas PN Mfn2cKO signifikan nurun (Gambar S4C).
(A) Analisis perdalanen waktu tingkat ekspresi kompleks OXPHOS. Ipertimbangkan saja protein si P<0,05 ibas 8 minggu (ANOVA dua arah). Garis titik-titik: La lit penyesuaien adi ibandingken ras CTRL. (B) Kiri: Contoh bagin otak si lit labelna alu antibodi anti-MTCO1 (batang skala, 20 μm). Daerah si ingan badan sel Purkinje itutupi alu warna kuning. Kanan : Kuantifikasi kadar MTCO1 (analisis varians searah; n = 7 seh 20 sel si ianalisis ibas telu tikus nari). (C) Analisis qPCR nomor salinen mtDNA i bas PN si iurutken (analisis varians searah; n = 3 seh ku 7 tikus). (D) Kiri: Contoh irisen otak si lit labelna alu antibodi anti-DNA (batang skala, 20 μm). Daerah si ingan badan sel Purkinje itutupi alu warna kuning. Kanan : Kuantifikasi lesi mtDNA (analisis varians searah; n = 5 seh 9 sel ibas telu tikus nari). (E) Contoh bagin serebelum akut si ncidahken sel mitoYFP + Purkinje (panah) i bas rekaman penjepit tambalen seluruh sel. (F) Kuantifikasi kurva IV. (G) Rekaman perwakilen suntikan arus depolarisasi i bas sel Purkinje CTRL ras Mfn2cKO. Top trace : Pulsa si pemena si memicu AP. Jejak si arah teruh : Frekuensi AP si maksimal. (H) Kuantifikasi masuken spontan pascasinaptik (sPSP). Jejak rekaman si mewakili ras rasio zoomna ituriken i bas (I). Analisis varians sada arah si ianalisis n = 5 seh ku 20 sel ibas telu tikus nari. Data ikataken alu rata-rata±SEM; *P<0,05 i bas; **P<0,01 i bas; ***P<0,001 eme. (J) Jejak perwakilen AP spontan si icatat alu make mode penjepit tambal berlubang. Jejak si meganjangna: Frekuensi AP si maksimal. Jejak si arah teruh : zoom sada AP. (K) Ngukurken frekuensi AP rata-rata ras maksimal sue ras (J). uji Mann-Witney; n = 5 sel si i analisis ibas empat tikus nari. Data ikataken alu rata-rata±SEM; labo penting.
Kerusaken OXPHOS si jelas terdeteksi ibas Mfn2cKO PN si umurna 8 minggu, si ncidahken maka fungsi fisiologis neuron parah abnormal. Emaka, ianalisis kami karakteristik listrik pasif neuron si kurang OXPHOS i bas 4 seh ku 5 minggu ras 7 seh ku 8 minggu alu ngelakoken rekaman penjepit tambalen seluruh sel i bas irisen serebelum akut (Gambar 2E). La isangka-sangka, rata-rata potensi membran istirahat ras resistensi masuken neuron Mfn2cKO mirip ras kontrol, aminna pe lit perbedan halus antar sel (Tabel 1). Bagepe ibas umur 4 seh ku 5 minggu, la lit perubahen si signifikan ibas hubungen arus-tegangan (kurva IV) si idatken (Gambar 2F). Tapi, la lit neuron Mfn2cKO si umurna 7 seh ku 8 minggu si selamat i bas rejimen IV (langkah hiperpolarisasi), si ncidahken maka lit sensitivitas si jelas nandangi potensi hiperpolarisasi i bas tahap akhir enda. Sebalikna, i bas neuron Mfn2cKO, arus depolarisasi si erbahanca debit potensial aksi berulang (AP) itoleransi alu mehuli, si ncidahken maka pola debitna secara keseluruhan la signifikan berbeda ras neuron kontrol si umurna 8 minggu (Tabel 1 ras Gambar 2G). Bagepe frekuensi ras amplitudo arus postsinaptik spontan (sPSC) sebanding ras kelompok kontrol, janah frekuensi peristiwa meningkat ibas 4 minggu nari ku 5 minggu ku 7 minggu ku 8 minggu alu peningkatan si seri (Gambar 2, H ras I). Masa pendewasaan sinaptik ibas PN (25). Hasil si seri idatken kenca tambalen PNs si berlubang. Konfigurasi enda mencegah kemungkinan kompensasi cacat ATP seluler, bagi si banci terjadi i bas rekaman penjepit tambal seluruh sel. Secara khusus, potensi membran istirahat ras frekuensi penembaken spontan neuron Mfn2cKO la terpengaruh (Gambar 2, J ras K). Singkatna, hasil enda ncidahken maka PN si lit disfungsi OXPHOS si jelas banci ngadapi pola debit frekuensi tinggi alu mehuli, ncidahken maka lit mekanisme kompensasi si banci erbahanca ia banci mempertahanken tanggapen elektrofisiologis si hampir normal.
Data inyatakan alu rata-rata ± SEM (analisis varians searah, uji perbandingen berganda Holm-Sidak; *P<0,05). Nomor unitna ituriken alu kurung.
Kami bertekad guna menyelidiki apakah lit kategori ibas dataset proteomik (Gambar 1G) mencakup jalur si banci melawan kekurangan OXPHOS si parah, alu bage menjelasken ngkai maka PN si terkena banci mempertahanken elektrofisiologi si hampir normal (Gambar 2, E seh ku K). . Analisis proteomik ncidahken maka enzim si terlibat ibas katabolisme asam amino berantai bercabang (BCAA) secara signifikan up-regulate (Gambar 3A ras Gambar S5A), ras produk akhir asetil-CoA (CoA) ntah pe suksinil CoA banci melengkapi trikarboksilat ibas arteriosklerosisTCA). Ijumpai kami maka kandungan transaminase BCAA 1 (BCAT1) ras BCAT2 duana meningkat. Kalak enda mengkatalisis langkah pertama katabolisme BCAA alu menghasilken glutamat ibas α-ketoglutarat nari (26). Kerina subunit si membentuk kompleks keto asam dehidrogenase (BCKD) rantai bercabang iaturken ku datas (kompleks e mengkatalisis dekarboksilasi selanjutna ras si la banci ibalikken i bas rangka karbon BCAA si ihasilken) (Gambar 3A ras Gambar S5A). Tapi, la lit perubahen si jelas i bas BCAA sendiri si idatken i bas PN si iurutken, si banci saja erkiteken peningkatan pengambilan sel asam amino esensial enda ntah pe penggunaan sumber si deban (glukosa ntah pe asam laktat) guna melengkapi siklus TCA (Gambar S5B). PN si kurang OXPHOS pe ncidahken peningkatan penguraian glutamin ras aktivitas transaminasi ibas umur 8 minggu, si banci teridah arah up-regulasi enzim mitokondria glutaminase (GLS) ras glutamin piruvat transaminase 2 (GPT2) (Gambar 3, A ras C). Perlu siteh maka up-regulasi GLS terbatas ku isoform glutaminase C si isambung (GLS-GAC) (perubahen Mfn2cKO/CTRL kurang lebih 4,5 kali lipat, P = 0,05), ras up-regulasi spesifikna i bas jaringan biokanker Banci mendukung mitonergiondrial. (27).
(A) Peta panas ncidahken perubahen lipat kadar protein guna rute si enggo itentuken i bas 8 minggu. (B) Contoh sada irisen otak si lit labelna alu antibodi anti-PCx (batang skala, 20 μm). Panah si warnana kuning nuduhken ku badan sel Purkinje. (C) Analisis ekspresi protein perdalanen waktu si iidentifikasi sebage kandidat penting guna aterosklerosis (uji t berganda, *FDR <5%; n = 3-5 tikus). (D) I datas : Diagram skematis si ncidahken cara si berbeda masuk ku karbon si lit labelna si lit i bas [1-13C]piruvat tracer (ertina, arah PDH ntah pe rute trans-arteri). I teruh : Bagan biola ncidahken persentase karbon si lit labelna sada (M1) si iubah jadi asam aspartat, asam sitrat ras asam malat kenca ibere label irisen otak kecil akut alu [1-13C]piruvat (uji t berpasangan; ** P <0,01). (E) Analisis sejarah waktu si komprehensif kerna dalan si itunjukken. Hanya mempertimbangkan protein si lit P<0,05 ibas 8 minggu . Garis putus-putus : la lit nilai penyesuaien (analisis varians dua arah; * P <0,05; *** P <0,001). Data ikataken alu rata-rata±SEM.
Ibas analisis kami, katabolisme BCAA enggo jadi salah sada jalur kunci up-regulasi. Fakta enda tuhu-tuhu ncidahken maka volume ventilasi si masuk ku siklus TCA banci berubah i bas PN si kurang OXPHOS. Enda banci mewakili bentuk utama rewiring metabolisme neuron, si banci berdampak langsung ku fisiologi neuron ras kelangsungan hidup sedekah pemeliharaan disfungsi OXPHOS si parah. Sesuai ras hipotesis enda, idat kami maka enzim anti-aterosklerotik utama PCx iatur ku datas (Mfn2cKO/CTRL berubah kurang lebih 1,5 kali; Gambar 3A), si mengkatalisis konversi piruvat jadi oksaloasetat (28), si iakapna lit i bas ekspresi tostrocy in9. 30). Konsisten ras hasil proteomik, mikroskop konfokal ncidahken maka ekspresi PCx secara spesifik ras signifikan meningkat i bas PN si kurang OXPHOS, sedangken reaktivitas PCx terutama terbatas ku sel glial Bergmann si berdekatan i bas kontrol (Gambar 3B). Guna nguji secara fungsional upregulasi PCx si iperhatiken, irawat kami irisen otak kecil akut alu [1-13C]piruvat tracer. Sanga piruvat ioksidasi alu piruvat dehidrogenase (PDH), label isotopna bene , Tapi imasukken ku bas perantara siklus TCA sanga piruvat imetabolisme alu reaksi pembuluh darah (Gambar 3D). I bas mendukung data proteomik kami, iperdiateken kami melala penanda i bas tracer enda i bas asam aspartat irisen Mfn2cKO, sedangken asam sitrat ras asam malat pe lit tren moderat, aminna pe la signifikan (Gambar 3D).
I bas neuron dopamin tikus MitoPark si lit disfungsi mitokondria si isebabken neuron dopamin secara khusus ncedai gen faktor transkripsi mitokondria A (Tfam) (Gambar S6B), ekspresi PCx pe secara signifikan up-regulated (31), si ncidahken maka asam aseton disfungsi arteriosklerosis si OKSFOS ibas kula. Perlu siteh maka enggo idatken maka enzim-enzim unik (32-34) si banci saja iekspresiken i bas neuron si banci saja lit hubungenna ras arteriosklerosis secara signifikan iaturken ku datas i bas PN si kurang OXPHOS, misalna propionil-CoA karboksilase (PCC-A), Malonil-CoA mitochilCoA mengubah propionil-CoA jadi . enzim 3 (ME3), si peran utamana eme guna ndatken mulihi piruvat ibas malat nari (Gambar 3, A ras C) (33, 35). Selain si e, idat kami peningkatan si signifikan i bas enzim Pdk3, si fosforilasi ras alu bage inaktifken PDH (36), sedangken la lit perubahen si terdeteksi i bas enzim Pdp1 si mengaktifken PDH ntah pe kompleks enzim PDH e sendiri (Gambar 3A). Secara konsisten, i bas PN Mern2cKO, fosforilasi subunit α1 subunit α (PDHE1α) komponen piruvat dehidrogenase E1 kompleks PDH i bas Ser293 (si itandai menghambat aktivitas enzim PDH) meningkat ( Gambar S6C) (Gambar S6C). Piruvat la lit akses pembuluh darahna.
Si terakhir, idat kami maka jalur super biosintesis serin ras glisin, siklus mitokondria folat (1C) si terkait ras biosintesis prolin (Gambar 1G ras Gambar S5C) kerinana secara signifikan up-regulated, menurut laporen, i bas proses aktivasi. Jaringan si lit i sekelewetna iaktifken alu disfungsi mitokondria (5-7). Analisis konfokal si mendukung data proteomik enda ncidahken maka i bas PN si la lit OXPHOS, irisen otak tikus si umurna 8 minggu ibahan serin hidroksimetiltransferase 2 (SHMT2), enzim kunci siklus folat mitokondria. Respon imun si signifikan (Gambar S5D). I bas 13 irisen otak akut si iinkubasi alu CU-glukosa, percobaan pelacaken metabolisme lebih lanjut menegasken up-regulasi biosintesis serin ras prolin, si ncidahken maka fluks isoform karbon ku serin ras prolin meningkat (Gambar S5E). Erkiteken reaksi si ipromosiken GLS ras GPT2 ertanggung jawab nandangi sintesis glutamat i bas glutamin nari ras transaminasi antara glutamat ras α-ketoglutarat, upregulasina ncidahken maka neuron si kurang OXPHOS lit peningkatan permintaan glutamat , Hal enda mungkin bertujuan guna mempertahanken peningkatan biosintesis proC (Gambar5). Berbeda ras perubahen enda, analisis proteomik astrosit serebelum i bas tikus Mfn2cKO spesifik PN ncidahken maka jalur-jalur enda (termasuk kerina antiperoksidase) la berubah secara signifikan i bas ekspresi, alu bage ncidahken Pengalihen metabolisme enda selektif nandangi PN si terdegradasi ku G (Gbr. S6,).
Singkatna, analisis-analisis enda ncidahken pola aktivasi temporal jalur metabolisme tertentu si berbeda secara signifikan i bas PN. Aminna pe fungsi mitokondria neuron si la normal banci erbahanca aterosklerosis dini ras remodeling 1C (Gambar 3E ras Gambar S5C), bahkan perubahen si banci iprediksi i bas ekspresi kompleks I ras IV, perubahen sintesis serin de novo e hanya Ia hanya jadi teridah i bas tahap akhir. Disfungsi OXPHOS (Gambar 3E ras Gambar S5C). Temuan enda mendefinisiken proses si beruruten i ja mitokondria (siklus 1C) ras sitoplasma (biosintesis serin) si ibahan stres merespon secara sinergis ras peningkatan aterosklerosis i bas siklus TCA guna membentuk kembali metabolisme neuron.
PN si kurang OXPHOS si umurna 8 minggu banci mempertahanken aktivitas eksitasi frekuensi tinggi ras mengalami rekoneksi metabolisme si signifikan guna mengkompensasi disfungsi mitokondria. Penemuan enda mpeturah sada kemungkinan si menarik maka aminna pe i bas paksa enda, sel-sel enda banci ka Ngaloken intervensi terapi guna menunda ntah pe mencegah neurodegenerasi. Melawensa. Kemungkinan enda iselesaikan kami arah dua intervensi mandiri. I bas metode si pemena, irancang kami vektor virus si erhubungen ras adeno (AAV) si bergantung ku Cre gelah MFN2 banci iekspresiken secara selektif i bas PN si kurang OXPHOS in vivo (Gambar S7A). AAV si mengkode MFN2 ras gen reporter neon mCherry (Mfn2-AAV) iverifikasi i bas kultur neuron primer secara in vitro, si erbahanca MFN2 iekspresiken alu cara si bergantung man Cre ras menyelamatken morfologi mitokondria, alu bage mencegah neuromutasi i bas neuron Mfn, B Gambar S7). Selanjutna, ilakoken kami percobaan in vivo guna secara stereotaktis ngerehken Mfn2-AAV si umurna 8 minggu ku korteks serebelum Mfn2cKO ras tikus kontrol, ras ianalisis tikus si umurna 12 minggu (Gambar 4A). Tikus Mfn2cKO si irawat mate (Gambar 1, A ras B) (16). Transduksi virus in vivo erbahanca lit ekspresi selektif PN ibas piga-piga lingkaran otak kecil (Gambar S7, G ras H). Suntiken AAV kontrol si mengekspresiken mCherry saja (Ctrl-AAV) la lit pengaruhna si signifikan nandangi tingkat degenerasi saraf i bas rubia-rubia Mfn2cKO. Sebalikna, analisis Mfn2cKO si i transduksi alu Mfn2-AAV ncidahken efek perlindungan si signifikan i bas lapisen sel PN (Gambar 4, B ras C). Secara khusus, kepadaten neuron tempa-tempa hampir la terbedaken ras rubia-rubia kontrol (Gambar 4, B ras C, ras Gambar S7, H ras I). Ekspresi MFN1 tapi labo MFN2 seri efektifna ibas menyelamatken kematen neuron (Gambar 4C ras Gambar S7, C ras F), si ncidahken maka ekspresi MFN1 ektopik banci secara efektif melengkapi kekurangan MFN2. Analisis selanjutna i bas tingkat PN tunggal ncidahken maka Mfn2-AAV sebagian besar menyelamatken ultrastruktur mitokondria, normalisasi tingkat mtDNA, ras membalikken ekspresi si tinggi penanda anti-angiogenesis PCx (Gambar 4, C seh ku E ). Pemeriksaan visual tikus Mfn2cKO si iselamatken ibas keadaan istirahat ncidahken maka postur ras gejala motorikna (gerakan S1 seh ku S3) enggo reh ulina. Kesimpulenna, percobaan enda ncidahken maka penundaan pengenalan kembali MFN2 ku bas PN si kekurangan parah OXPHOS cukup guna membalikken konsumsi mtDNA ras menginduksi aterosklerosis, alu bage mencegah degenerasi akson ras kematen neuron in vivo.
(A) Skema si ncidahken jadwal percobaan guna nyuntikken AAV si ngkodeken MFN2 sanga jalur metabolisme si itunjukken iaktifken. (B) Gambar konfokal perwakilen irisen otak kecil si umurna 12 minggu si itransduksi i bas 8 minggu i bas tikus Mfn2cKO ras ilabeli alu antibodi anti-Calbindin. Kanan: Skala serat akson. Skala zoom akson eme 450 ras 75 μm. (C) Kiri : Kuantifikasi kepadaten sel Purkinje ibas lingkaran transduksi AAV (AAV+) (analisis varians searah; n = 3 tikus). Kanan: analisis fokus mtDNA ibas PN si i transduksi ibas minggu 12 (uji t si la erpasangan; n = 6 sel ibas telu tikus nari). * P <0,05 i bas; ** P <0,01 eme. (D) Mikrograf elektron transmisi perwakilen PNs bagin otak Mfn2cKO si itransduksi alu vektor virus si itunjukken. Topeng si warnana pink nggambarken daerah si ingan dendrit, janah kotak si ertitik-titik si warnana kuning nggambarken zoom si isediaken i sebelah kanan; n nggambarken inti. Skala batangna, 1μm. (E) ncidahken contoh pewarnaan PCx ibas PN si i transduksi ibas 12 minggu. Skala batangna, 20μm. OE, ekspresi si berlebihen; FC, lipat perubahen.
Si terakhir, iselidiki kami pentingna kelangsungan hidup sel si ibahan peroksidase i bas PN si enggo mengalami disfungsi OXPHOS. Ibahan kami mCherry si ngkodeken AAV-shRNA (RNA jepit rambut si gendek) si khusus itargetkan mRNA PCx tikus (AAV-shPCx), janah isuntikken kami virus e ntah pe kontrolna si icampur (AAV-scr) ku bas otak tikus Mfn2cKO. Suntiken e ilakoken ibas minggu peempatken umurna (Gambar 5A) guna ndatken knockdown PCx si efektif ibas periode ekspresi PCx meningkat (Gambar 3C) ras lapisen sel PN tetap utuh (Gambar 1A). Perlu siteh maka ngeruntuhken PCx (Gambar S8A) erbahanca terjadi percepatan kematen PN si signifikan, si terbatas ku ring si terinfeksi (Gambar 5, B ras C). Guna ngantusi mekanisme efek metabolisme si ibahan PCx up-regulasi, ipelajari kami status redoks PN kenca PCx knockdown ras biosensor optik si imediasi AAV Grx1-roGFP2 secara serentak iekspresiken (Gambar S8, B seh ku D) guna ngevaluasi glutation potensial peptida3 si relatif). Jenari, ilakoken kami mikroskopi pencitraan seumur hidup fluoresensi dua foton (FLIM) i bas irisen otak akut Mfn2cKO si umurna 7 minggu ntah pe littermates kontrol guna mendeteksi potensi perubahen status redoks sitoplasma kenca enggo iverifikasi kondisi FLIM (Gambar S8, E seh ku G). Analisis ncidahken peningkatan keadaan oksidasi si signifikan ibas sada PN Mfn2cKO si kurang ekspresi PCx, si berbeda ras neuron kontrol ntah pe PN Mfn2cKO si mengekspresiken shRNA si enggo i scrambled saja (Gambar 5, D ras E). Adi ekspresi PCx i down-regulate, persentase PN Mfn2cKO si ncidahken keadaan si sangat teroksidasi meningkat lebih telu kali lipat (Gambar 5E), si ncidahken maka up-regulasi PCx mempertahanken kapasitas redoks neuron si enggo degeneratif.
(A) Skema si ncidahken jadwal percobaan guna nyuntikken AAV si ngkodeken shPCx sanga jalur metabolisme si itunjukken iaktifken. (B) Foto konfokal perwakilen bagin otak kecil si umurna 8 minggu i bas tikus Mfn2cKO si i transduksi ras ilabeli alu antibodi anti-kalsineurin i bas 4 minggu. Skala batangna, 450μm. (C) Kuantifikasi kepadaten sel Purkinje i bas loop si itransduksi AAV (analisis varians sada arah; n = 3 seh ku 4 tikus). Data ikataken alu rata-rata±SEM; ***P<0,001 eme. (D) Gambar FLIM perwakilen ncidahken rata-rata umur PN si umurna 7 minggu si mengekspresiken sensor redoks glutation Grx1-roGFP2 i bas kondisi eksperimen si enggo itentuken. LUT (tabel pencarian) rasio : interval waktu kelangsungan hidup (ibas pikodetik). Skala batangna, 25μm. (E) Histogram ncidahken persebaran nilai masa hidup Grx1-roGFP2 i bas (D) (n=158 seh ku 368 sel i bas dua tikus i bas tep-tep kondisi). Bagan pie i datas tep-tep histogram : ncidahken jumlah sel si nilai umurna secara signifikan lebih gedang (merah, teroksidasi) ntah pe lebih gendek (biru, berkurang), si melebihi 1 SD nilai umur rata-rata i bas CTRL-AAV-scr. (F) Model si iusulken ncidahken efek perlindungen upregulasi PCx neuronal.
Secara keseluruhen, data si isehken kami i jenda ncidahken maka re-ekspresi MFN2 banci sepenuhna menyelamatken PN si enggo lanjut alu defisiensi OXPHOS si parah, kekurangen mtDNA si parah, ras morfologi mirip ista si luar biasa abnormal, alu bage mereken kemajun si terus-menerus bahkan i bas pinakit si enggo lanjut. Neurodegenerasi mereken bukti si banci ibalikken kerna tahap ope sel mate. Tingkat fleksibilitas metabolisme enda lebih itekanken alu kemampuan neuron guna menginduksi aterosklerosis (rewiring siklus TCA), si menghambat ekspresi PCx ibas PN si kurang OXPHOS ras meningkatken kematen sel, alu bage berperan melindungi (Gambar 5F).
I bas penelitian enda, ibereken kami bukti maka tanggapen PN nandangi disfungsi OXPHOS eme secara bertahap konvergen ku aterosklerosis siklus TCA arah jalur aktivasi diferensial si iaktifken program metabolisme. Ikonfirmasi kami analisis proteomik alu melala metode pelengkap ras ngungkapken maka sanga itantang disfungsi mitokondria si parah, neuron lit bentuk elastisitas metabolisme si lenga iteh sebelumna. Si erbahanca kita sengget, kerina proses rewiring e lenga tentu nandai keadaan metabolisme terminal si ngiringi neurodegenerasi secara bertahap ras la banci ibalikken, tapi data kami ncidahken maka banci saja e merupaken neuron pemeliharaan bahkan i bas tahap ope sel mate Mekanisme kompensasi fungsional. Temuan enda ncidahken maka neuron lit tingkat plastisitas metabolisme si cukup mbelin i bas kula. Fakta enda membuktiken maka pengenalan kembali MFN2 i bas pudi wari banci membalikken ekspresi penanda metabolisme kunci ras mencegah degenerasi PN. Sebalikna, e menghambat aterosklerosis ras mempercepat saraf. kalak si ertranseksual.
Salah sada temuan si paling menarik ibas penelitian kami eme PN si kurang OXPHOS banci memodifikasi metabolisme siklus TCA alu up-regulate enzim si secara khusus merangsang arteriosklerosis. Penataan ulang metabolisme eme sada ciri umum sel kanker, piga-piga si mengandalken glutamin guna melengkapi perantara siklus TCA guna menghasilken setara reduksi, si mendorong rantai pernapasen ras mempertahanken produksi prekursor biosintesis lipid ras nukleotida (39 , 40). Sebuah penelitian si mbaru-mbaru enda ncidahken maka ibas jaringan tepi si mengalami disfungsi OXPHOS, rekoneksi metabolisme glutamin/glutamat pe jadi sada fitur si menonjol (5, 41), ija arah masukna glutamin ku siklus TCA tergantung ku Erkiteken beratna cedera OXPHOS (41). ). Tapi, kurang bukti si jelas kerna kemiripen kai pe plastisitas metabolisme neuron i bas kula ras kemungkinan relevansina i bas konteks pinakit. I bas sada penelitian in vitro si mbaru-mbaru enda, neuron kortikal primer teridah banci memobilisasi kolam glutamat guna transmisi saraf, alu bage banci mendorong metabolisme oksidatif ras aterosklerosis i bas kondisi stres metabolisme (42). Perlu siteh maka i bas penghambaten farmakologis enzim siklus TCA suksinat dehidrogenase, karboksilasi piruvat ipercayai banci mempertahanken sintesis oksaloasetat i bas neuron granul serebelum si ikulturken (34). Tapi, relevansi fisiologis mekanisme enda ras jaringan otak (i ​​ja aterosklerosis iakap terutama terbatas ku astrosit) tetap lit signifikansi fisiologis si penting (43). I bas hal enda, data kami ncidahken maka PN si ceda erkiteken OXPHOS i bas kula banci beralih ku degradasi BCAA ras karboksilasi piruvat, si jadi dua sumber utama suplementasi perantara kolam TCA. Aminna pe kontribusi si ianggap katabolisme BCAA nandangi metabolisme energi neuron enggo iusulken, selain peran glutamat ras GABA guna neurotransmisi (44), lenga lit bukti kerna mekanisme enda in vivo. Emaka menukah kal berspekulasi maka PN si la erfungsi banci secara otomatis mengkompensasi konsumsi perantara TCA si idorong proses asimilasi alu meningkatken aterosklerosis. Secara khusus, upregulasi PCx mungkin iperluken guna mempertahanken peningkatan permintaan asam aspartat, si isaranken i bas sel-sel si erkembang biak si lit disfungsi mitokondria (45). Tapi, analisis metabolomik kami la ncidahken perubahen si signifikan i bas tingkat steady-state asam aspartat i bas PN Mfn2cKO (Gambar S6A), si ianggap ncidahken pemanfaatan metabolisme asam aspartat si berbeda antara sel-sel si erkembang biak ras neuron pasca-mitosis . Aminna pe mekanisme si tepat kerna upregulasi PCx i bas neuron si la erfungsi in vivo tetap denga ikarakterisasi, tapi icidahken kami maka respon prematur enda berperan penting i bas mempertahanken keadaan redoks neuron, si icidahken i bas percobaan FLIM i bas irisen otak kecil. Secara khusus, mencegah PNs ibas up-regulating PCx banci erbahanca keadaan lebih teroksidasi ras mempercepat kematen sel. Aktivasi degradasi BCAA ras karboksilasi piruvat labo cara guna menciriken jaringan tepi disfungsi mitokondria (7). Emaka, tempa-tempa ia jadi fitur prioritas neuron si kurang OXPHOS, aminna pe labo sada-sadana fitur, si penting man neurodegenerasi. .
Penyakit otak kecil eme jenis pinakit neurodegeneratif si heterogen si biasana teridah alu ataksia ras rusur ncedai PN (46). Populasi neuron enda khususna rentan nandangi disfungsi mitokondria erkiteken degenerasi selektifna i bas tikus cukup guna mereproduksi melala gejala motorik si jadi ciri khas ataksia spinoserebel manusia (16, 47, 48). Menurut laporen, model tikus transgenik si lit gen mutan ihubungken ras ataksia spinoserebellar manusia ras lit disfungsi mitokondria (49, 50), si menekanken pentingna mpelajari konsekuensi defisiensi OXPHOS i bas PNPH. Emaka, khususna cocok guna ngisolasi ras mpelajari populasi neuron si unik enda alu efektif. Tapi, nginget maka PN sensitif kel nandangi tekanan ras menyumbang proporsi si rendah i bas kerina populasi sel otak kecil, man melala penelitian berbasis omics, pemisahan selektif i bas ia selaku sel si lengkap tetap jadi aspek si menantang. Aminna pe hampir la mungkin banci idatken kurangna kontaminasi mutlak jenis sel si deban (khususna jaringan dewasa), kami menggabungken langkah disosiasi si efektif ras FACS guna ndatken jumlah neuron si layak si cukup guna analisis proteomik hilir, ras lit cakupen protein si Cukup tinggi i bas e si cerebel ras) (51). Alu njaga kelangsungan hidup sel-sel si lengkap, metode si isediaken kami i jenda memungkinken kami labo saja guna mereksa perubahen jalur metabolisme i bas mitokondria, tapi pe guna mereksa perubahen i bas rekan-rekan sitoplasma-na, si melengkapi penggunaan tag membran mitokondria i bas tipe number sel for the new metho of michond (52, 53). Metode si ituriken kami enda labo saja berhubungen ras penelitian sel Purkinje, tapi banci alu gampang iterapken ku jenis sel kai pe guna ngatasi perubahen metabolisme i bas otak si sakit, termasuk model disfungsi mitokondria si deban.
Si terakhir, enggo siidentifikasi jendela terapi i bas proses penataan kembali metabolisme enda si banci benar-benar membalikken tanda-tanda kunci stres seluler ras mencegah degenerasi neuron. Emaka, memahami implikasi fungsional rewiring si ituriken i jenda banci mereken wawasen mendasar kerna kemungkinan perawaten guna mempertahanken daya tahan neuron sedekah disfungsi mitokondria. Penelitian i bas masa si reh si ertujun guna membedah perubahen metabolisme energi i bas jenis sel otak si deban iperluken guna lengkap ngungkapken keberlakuan prinsip enda man pinakit saraf si deban.
Tikus MitoPark enggo ituriken sebelumna (31). Tikus C57BL/6N si lit gen Mfn2 si mengapit loxP enggo ituriken sebelumna (18) ras i silangken ras tikus L7-Cre (23). Keturunen heterozigot ganda si ihasilken kenca si e isilangken ras tikus homozigot Mfn2loxP/Mfn2loxP guna menghasilken knockout gen spesifik Purkinje guna Mfn2 (Mfn2loxP/Mfn2loxP; L7-cre). I bas sada himpunan bagian perkawinen, alel Gt (ROSA26) SorStop-mito-YFP (henti-mtYFP) ipetandaken arah persilangen tambahen (20). Kerina prosedur binatang ilakoken sue ras pedoman Eropa, nasional ras lembaga ras isetujui LandesamtfürNatur i Umwelt ras Verbraucherschutz, Rhina Utara-Westfalia, Jerman. Kerja-kerja hewan pe ngikutken bimbingen Federasi Eropa Asosiasi Ilmu Hewan Laboratorium.
Kenca enggo i bius dislokasi serviks diberu si sangana hamil, embrio tikus e i isolasi (E13). Korteks ibedah ibas Larutan Garam Seimbang Hanks (HBSS) si itambahi Hepes 10 mM ras ibereken ku Media Elang Modifikasi Dulbecco si mengandung papain (20 U/ml) ras sistein (1μg/ml). Inkubasi jaringan e i bas DMEM) ras dissosiasiken alu pencernaan enzimatik. Ml) ibas suhu 37°C selama 20 menit, kenca si e i giling secara mekanis ibas DMEM si itambahi alu 10% serum sapi janin. Sel-sel ibenihken ku coverslip kaca si ilapisi alu polilisin alu kepadaten 2×106 per piring kultur 6 cm ntah pe alu kepadaten 0,5×105 sel/cm2 guna analisis pencitraan. Kenca 4 jam, media e iganti alu media bebas serum Neurobasal si mengandung suplemen B27 1% ras GlutaMax 0,5 mM. Neuron-neuron e kenca si e ipertahanken i bas suhu 37°C ras 5% CO2 sepanjang percobaan, janah ibereken pangan sekali seminggu. Guna menginduksi rekombinasi secara in vitro, 3μl (piring kultur 24 sumur) ntah pe 0,5μl (piring 24 sumur) vektor virus AAV9 berikut ipake guna ngobati neuron ibas wari si peduaken secara in vitro: AAV9.CMV.PI.eGFP. 105530-AAV9) ras nomor katalog 105545-AAV9.
DNA pelengkap Mfn1 ras Mfn2 tikus (idatken arah plasmid Addgene #23212 ras #23213, masing-masing) itandai alu uruten V5 (GKPIPNPLLGLDST) i ujung C, janah menyatu ras mCherry i bas bingkai arah uruten T2A. Grx1-roGFP2 eme hadiah ibas TP Dick DFKZ nari. Alu mengganti kaset tdTomato alu make cara kloning konvensional, kaset e isubkloning ku tulang punggung pAAV-CAG-FLEX-tdTomato (nomor acuan Addgene 28306) guna menghasilken pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFGAV2-V5, pAAV-CAG-FLEX-tdTomato. I bas bahan enda, ijelasken uga carana nggunaken vektor pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2. Strategi si seri ipake guna menghasilken vektor kontrol pAAV-CAG-FLEX-mCherry. Guna menghasilken konstruksi AAV-shPCx, iperluken sada vektor AAV plasmid (VectorBuilder, pAAV [shRNA] -CMV-mCherry-U6-mPcx- [shRNA#1]), si i je lit uruten DNA si ngkodeken PCx tikus si itargetkan shRNA (5′ 3′) Ibas kendali promotor U6, mCherry ipake ibas kendali promotor CMV. Produksi vektor AAV bantu ilakoken sue ras petunjuk pabrikan (Cell Biolabs). Singkatna, pakelah plasmid transfer si maba mCherry-T2A-MFN2-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry-MFN2-V5), mCherry-T2A-MFN1-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) secara sementara Transfeksi sel 2900. (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) ntah pe Grx-roGFP2 (pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2) gen pengkodean, bagepe pengkodean protein kapsid AAV1 ras protein aksesoris Pengemasan plasmid plasmid, alu make metode kalsium fosfat. Supernatan virus kasar idatken alu siklus beku-cair ibas mandi es kering/etanol ras sel-sel si ilisis ibas saline penyangga fosfat (PBS). Vektor AAV imurniken alu ultrasentrifugasi gradien yodiksanol si la berkelanjuten (24 jam ibas 32.000 rpm ras 4°C) ras ikonsentrasiken alu make filter sentrifugal Amicon ultra-15. Titer genom AAV1-CAG-FLEX-mCherry (6,1×1012 GC/ml), AAV1-CAG-FLEX-mCherry (6,1×1012 GC/ml), AAV1-CAG-FLEX-mCherry (6,1×1012 GC/ml), AAV1-CAG-FLEX si iukur alu waktu si nyata, iukur alu waktu si tuhu-tuhu bagi si enggo ibahan sebelumna. (qPCR) -MFN1-V5 (1,9×1013 GC/ml) ras AAV1-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 (8,9×1012 GC/ml) si ibahan i bas bahan enda nari.
Neuron primer ikikis ibas PBS 1x si dingin bagi es, ipelet, kenca si e i homogenken ibas 0,5% Triton X-100 / 0,5% natrium deoksikolat/penyangga lisis PBS si mengandung fosfatase ras penghambat protease (Roche). Kuantifikasi protein ilakoken alu make uji asam bisinkoninat (Thermo Fisher Ilmiah). Protein-protein e kenca si e ipisahken alu elektroforesis gel SDS-poliakrilamida, kenca si e i blot ku membran poliviniliden fluorida (GE Healthcare). Blokir situs si la spesifik ras inkubasi alu antibodi primer (nen Tabel S1 guna lebih jelasna) i bas susu 5% i bas TBST (saline penyangga Tris ras Tween), langkah-langkah pencucian ras antibodi sekunder i bas TBST Inkubasi. Inkubasi alu antibodi primer semalam i bas suhu +4°C. Kenca enggo icuci, ibahan antibodi sekunder e 2 jam i bas suhu kamar. Selanjutna, alu inkubasi blot si seri ras antibodi anti-β-aktin, muaten si seri ikonfirmasi. Deteksi alu mengubah jadi kemiluminesen ras meningkatken kemiloluminesen (GE Healthcare).
Neuron si enggo leben ibenihken i bas penutup kaca ipertahanken alu 4% paraformaldehida (PFA)/PBS i bas titik waktu si enggo itentuken i bas suhu kamar selama 10 menit. Penutup e tangtangna iresap alu 0,1% Triton X-100/PBS selama 5 menit i bas suhu kamar, kenca si e i bas penyangga penghalang [3% albumin serum sapi (BSA)/PBS]. I bas wari si peduaken, coverslips e icuci alu penyangga penghalang ras iinkubasi alu antibodi sekunder si tepat si ikonjugasi alu fluorofor selama 2 jam i bas suhu kamar; dungna, sampel-sampel e icuci alu mehuli i bas PBS alu 4′,6-diamidino-2 -Fenilindol (DAPI) iwarnai kontra kenca si e ipertahanken i bas slide mikroskop alu Aqua-Poly/Mount.
Tikus (dilaki ras diberu) i bius alu suntikan intraperitoneal ketamin (130 mg/kg) ras xilazin (10 mg/kg) ras ibereken ku teruh kulit alu obat penawar sakit karprofen (5 mg/kg) , Janah itamaken i bas alat stereotaktik (Kopd a) alu peralaten war. Terbuka tengkorak ras pake bor gigi guna menipisken bagin korteks otak kecil si sesuai ras tulang mis (i bas lambda nari: ikur 1,8, lateral 1, sesuai ras lobus IV ras V). Pake jarum jarum suntik si melengkung guna alu megermet erbahan lubang si kitik i bas tengkorak gelah ula terganggu pembuluh darah i teruhna. Jenari kapiler kaca si itarik tipis e imasukken alu manjar-anjar ku bas lubang mikro (mulai -1,3 seh ku -1 i sisi ventral dura mater), janah 200 seh ku 300 nl AAV isuntikken ku bas injektor mikro (Narishige) alu jarum suntik manual (Narishige tisure) i bas periode tekanan waktu sever1. menit jendelana. Kenca dung infus, tamaken kapiler e 10 menit nari gelah virus e banci merambat alu lengkap. Kenca kapiler-kapiler e itarik, kulitna ijahit alu mehuli gelah la lit radang luka janah banci malem rubia-rubia e. Rubia-rubia e irawat alu obat penampat sakit (caspofen) piga-piga wari kenca operasi, i bas paksa si e kondisi fisikna ipantau alu megermet kenca si e i eutanasia i bas titik waktu si enggo itentuken. Kerina prosedur ilakoken sue ras pedoman Eropa, nasional ras lembaga janah isetujui LandesamtfürNatur i Umwelt ras Verbraucherschutz, Rhina Utara-Westfalia, Jerman.
Binatang e i bius alu ketamin (100 mg/kg) ras xilazin (10 mg/kg), janah jantungna i perfusi alu PBS 0,1 M lebe, kenca si e alu PFA 4% i bas PBS. Jaringan e ibedah ras ipertahanken ibas 4% PFA/PBS semalam ibas suhu 4°C. Piso si ergetar (Leica Microsystems GmbH, Wina, Austria) ipake guna nikapken bagin sagital (tebalna 50 μm) i bas otak si tetap i bas PBS nari. Adi la lit si itentuken, pewarnaan bagin-bagin si ngambang bebas ilakoken bagi si enggo ituriken i datas (13) i bas suhu kamar ras iaduk. Singkatna, pemena, irisen si idatken ipermeabilisasi alu 0,5% Triton X-100/PBS selama 15 menit i bas suhu kamar; bagi piga-piga epitope (Pcx ras Shmt2), alu i bas penyangga tris-EDTA i bas suhu 80°C (PH 9) panasken irisen-irisen e 25 menit asangken langkah enda. Selanjutna, bagin-bagin e iinkubasi alu antibodi primer (nen Tabel S1) i bas penyangga penghalang (3% BSA/PBS) i bas suhu 4°C semalam alu iaduk. Pepagina, bagin-bagin e icuci alu penyangga penghalang ras iinkubasi alu antibodi sekunder si tepat si ikonjugasi alu fluorofor sedekah 2 jam i bas suhu kamar; dungna, bagin-bagin e icuci alu mehuli i bas PBS, iwarnai alu DAPI, kenca si e ipertahanken alu AquaPolymount I bas slide mikroskop.
Mikroskop konfokal pemindaian laser (TCS SP8-X ntah pe Lembar Cahaya Digital TCS, Mikrosistem Leica) si ilengkapi alu laser cahaya putih ras laser ultraviolet 405 dioda ipake guna ncidahken gambaren sampel e. Alu menggairahken fluorofor ras mpepulung sinyal alu Detektor Hibrida (HyDs), perangkat lunak LAS-X ipake guna mpepulung gambar si ertumpuken si sue ras pengambilan sampel Nyquist alu mode beruruten: guna panel non-kuantitatif, sinyal si dinamis kal (misalna, i bas sel somatik ras dendrit) si dect i bas UFPN) mt . Modus si terangR). Gating mulai 0,3 seh ku 6 ns idalanken guna ngurangi latar belakang.
Pencitraan waktu nyata kerna sel-sel si iurutken. Kenca iurutken i bas media Neurobasal-A si mengandung suplemen B27 1% ras GlutaMax 0,5 mM, sel-sel e minter ibenihken i bas slide kaca si ilapisi poli-l-lisin (μ-Slide8 Sumur, Ibidi, nomor katalog 80826) , Janah kenca si e ijaga i bas suhu a°C ras 300 sel. guna nggeluh. Pencitraan waktu nyata ilakoken alu mikroskop konfokal pemindaian laser Leica SP8 si ilengkapi alu lensa objektif minak laser putih, HyD, 63×[1,4 bukaan numerik (NA)] ras panggung pemanasen.
Tikus e mis i bius alu karbon dioksida ras i putusken takalna, otakna mis ibuat i bas tengkorak nari, janah i potong jadi bagin sagital si tebalna 200 μm (guna percobaan pelabelan 13C) ntah pe tebalna 275 μm (guna dua percobaan foton) si iisi alu bahan-bahan crece berikut The VHr5. Ilmiah, Walldorf, Jerman) iisi alu zat-zat si tersena i teruh enda: 125 mM es dingin, jenuh karbon (95% O2 ras 5% CO2) rendah Ca2 + cairan otak tulang belakang buaten (ACSF) NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM natrium m32. glukosa, CaCl2 0,5 mM ras MgCl2 3,5 mM (tekanan osmotik 310 seh 330 mmol). Pindahken irisen otak si idatken ku ruang pra-inkubasi si mengandung Ca2 + ACSF si lebih tinggi (NaCl 125,0 mM, KCl 2,5 mM, penyangga natrium fosfat 1,25 mM, NaHCO3 25,0 mM, Ca2.glukosa 25,0 mM ras Ca2.0M m2). MgCl2) Sedang) pH 7,4 ras 310 seh ku 320 mmol).
Ibas proses pencitraan, irisen-irisen e ipindahken ku ruang pencitraan si khusus, janah percobaan ilakoken alu perfusi ACSF si terus-menerus ibas suhu si tetap 32° seh ku 33°C. Mikroskop pemindaian laser multifoton (TCS SP8 MP-OPO, Mikrosistem Leica) si ilengkapi alu lensa objektif Leica 25x (NA 0,95, lau), laser Ti: Safir (Bunglon Visi II, Koheren) ipake guna pencitraan irisen. Modul FLIM (PikoHarp300, PikoKuant) si lit i bas bahan enda.
FLIM si lit i bas Grx1-roGFP2. Perubahen keadaan redoks sitoplasma PN iukur alu FLIM dua foton i bas irisen otak sagital, i ja biosensor Grx1-roGFP2 menargetkan PN. I bas lapisen PN, bidang akuisisi ipilih kira-kira 50 seh ku 80 μm i teruh permukaan irisen guna memastikan lit PN si layak (ertina, kurangna struktur manik-manik ntah pe perubahen morfologis neuron i sepanjang dendrit) ras sensor roGFP2 positif ganda ras pengkodean PCx iRNA sh mCeri). Pakelah gambar si sada tumpuken alu zoom digital 2x [panjang gelombang eksitasi: 890 nm; 512 nm 512 piksel si lit i bas]. Deteksi: HyD internal, kelompok filter fluoresein isotiosianat (FITC)] ras rata-rata gambar i bas 2 seh ku 3 menit ipake guna memastikan foton si cukup ipepulung (1000 foton total) guna pas kurva. Sensitivitas probe Grx1-roGFP2 ras verifikasi kondisi FLIM ilakoken alu memantau nilai masa hidup roGFP2 sanga nambahi H2O2 eksogen 10 mM ku perfusi ACSF (guna memaksimalken oksidasi, si erbahanca degreetizol of pengurangen, si erbahanca umur geluh pe reh kurangna) (Gambar S8, D seh ku G). Gunaken perangkat lunak FLIMfit 5.1.1 guna nganalisis hasil si idatken, pasken kurva peluruhen eksponensial tunggal i bas kerina gambar ku IRF si iukur (fungsi respon instrumen), janah χ2 kira-kira 1. Guna ngitung masa hidup sada PN, topeng e secara manual each life i bas sada saraf. ipake guna kuantifikasi.
Analisis potensi mitokondria si lit bas ia. Kenca bagin akut iinkubasi alu 100 nM TMRM langsung itambahken ku ACSF si iperfusi selama 30 menit, perubahen potensi mitokondria PN iukur alu mikroskop dua foton. Pencitraan TMRM ilakoken alu menggairahken probe i bas 920 nm ras make HyD internal (tetrametilrodamin isotiosianat: 585/40 nm) guna mpepulung sinyal; alu make panjang gelombang eksitasi si seri tapi make HyD internal si berbeda (FITC :525/50) guna ncidahken mtYFP. Gunaken plug-in Kalkulator Gambar ImageJ guna ngevaluasi potensi mitokondria i bas tingkat sel si sada. Singkatna, persamaan plug-in: sinyal = min (mtYFP, TMRM) ipake guna ngidentifikasi daerah mitokondria si ncidahken sinyal TMRM i Purkinje Somali i bas gambar konfokal tumpuken tunggal saluren si sesuai. Jenari luas piksel ibas masker si ihasilken iukur, jenari i normalisasi ibas gambar single-stack ambang batas si sesuai saluren mtYFP guna ndatken fraksi mitokondria si ncidahken potensi mitokondria.
Gambar e i dekonvolusi alu perangkat lunak Huygens Pro (Pencitraan Volume Ilmiah). Bagi gambar ubin si enggo ipindai, montase sada ubin ibahan alu make algoritma jahitan otomatis si isediaken perangkat lunak LAS-X. Kenca enggo kalibrasi gambar, pake ImageJ ras Adobe Photoshop guna ngolah gambar e lebih lanjut ras menyesuaiken terang ras kontrasna alu seragam. Gunaken Adobe Ilustrator guna persiapen grafis.
Analisis fokus mtDNA. Jumlah lesi mtDNA iukur i bas bagin otak si ilabeli alu antibodi nandangi DNA alu mikroskop konfokal. Tiap daerah sasaran ibahan guna badan sel ras inti tiap sel, janah daerah masing-masing iperhitungken alu make plug-in Multi Measure (perangkat lunak ImageJ). Kurangi luas inti ibas luas badan sel nari gelah dat luas sitoplasma. Si terakhir, plug-in Analyze Particles (perangkat lunak ImageJ) ipake guna secara otomatis ngukur titik-titik DNA sitoplasma si ncidahken mtDNA i bas gambar ambang batas, janah hasil si idatken inormalisasi ku rata-rata PN tikus CTRL. Hasilna ikataken alu jumlah rata-rata nukleosida per sel.
Analisis ekspresi protein si lit bas ia. Gunaken plug-in Kalkulator Gambar ImageJ guna ngevaluasi ekspresi protein i bas PN i bas tingkat sel tunggal. Singkatna, ibas gambar konfokal lapis tunggal saluren si sesuai, arah persamaan: sinyal = min (mtYFP, antibodi), daerah mitokondria si ncidahken imunoreaktivitas nandangi antibodi tertentu i Purkina iidentifikasi. Jenari luas piksel ibas masker si ihasilken iukur, jenari i normalisasi ibas gambar single-stack ambang batas si sesuai saluren mtYFP guna ndatken fraksi mitokondria protein si itampilken.
Analisis kepadaten sel Purkinje. Plug-in Cell Counter ImageJ ipake guna mengevaluasi kepadaten Purkinje alu mbagi jumlah sel Purkinje si ibilang alu gedang cincin otak si itempati sel-sel si ibilang.
Contoh persiapen ras pengumpulen. Otak-otak i bas kelompok kontrol ras tikus Mfn2cKO ipertahanken i bas 2% PFA/2,5% glutaraldehida i bas penyangga fosfat 0,1 M (PB), kenca si e ibahan bagin-bagin koronal alu make silia (Leica Mikrosysteme GmbH, Wina, Austria) (Ketebalen penyangga μm1 i The60). tetraoksida ras 1,5% kalium ferosianida ibas suhu kamar selama 1 jam. Bagin-bagin e icuci telu kali alu lau suling, kenca si e iwarnai alu etanol 70% si mengandung 1% uranil asetat selama 20 menit. Bagin-bagin e kenca e i dehidrasi i bas alkohol si ertingkat ras itamaken i bas resin epoksi Durcupan ACM (damar pengecoran Araldite M) (Ilmu Mikroskopi Elektron, nomor katalog 14040) i antara slide kaca si ilapisi silikon, janah dungna i bas suhu 60°C Polimerisasi i bas oven48. Daerah korteks otak kecil ipilih ras bagin-bagin si ultratipis 50 nm igunting i bas Leica Ultracut (Leica Mikrosysteme GmbH, Wina, Austria) ras ipilih i bas kisi-kisi celah tembaga 2×1 mm si ilapisi alu film polistirena. Bagin-bagin e iwarnai alu larutan uranil asetat 4% i bas H2O selama 10 menit, icuci alu H2O piga-piga kali, kenca si e alu sitrat timah Reynolds i bas H2O selama 10 menit, kenca si e icuci alu H2O piga-piga kali. Mikrograf ibahan alu mikroskop elektron transmisi Philips CM100 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, AS) alu make kamera digital TVIPS (Sistem Pengolahen Video ras Gambar Tietz) TemCam-F416 (TVIPS GmbH, Gauting, AS). Jerman).
Bagi tikus si terinfeksi AAV, otak ipisahken ras iiris jadi bagin sagital si tebalna 1 mm, janah otak si kitik iperiksa alu make mikroskop fluoresensi guna ngidentifikasi cincin si terinfeksi AAV (ertina, mCherry expressing). Percobaan i ja suntikan AAV menghasilken efisiensi transduksi lapisen sel Purkinje si seh kel tinggina (ertina hampir kerina lapisen) i bas sekurang-kurangna dua cincin otak si erturut-turut ngenca si ipake. Loop si itransduksi AAV i mikrodiseksi guna pasca fiksasi semalam (4% PFA ras 2,5% glutaraldehida i bas penyangga kakao 0,1 M) ras iproses selanjutna. Guna penyematan EPON, jaringan si tetap icuci alu penyangga kakao natrium 0,1 M (Applichem), ras iinkubasi alu OsO4 2% (os, Jasa Ilmu Pengetahuan; Caco) i bas penyangga kakao natrium 0,1 M (Applichem) 4 Jam, kenca si e icuci selama 2 jam. Ulangi 3 kali alu penyangga cocamide 0,1 M. Selanjutna, seri etanol si naik ipake guna inkubasi tiap larutan etanol ibas suhu 4°C selama 15 menit guna mendehidrasi jaringan. Jaringan e ipindahken ku propilen oksida ras iinkubasi semalam i bas EPON (Sigma-Aldrich) i bas suhu 4°C. Itamaken tisu e ku bas EPON si mbaru i bas suhu kamar 2 jam dekahna, kenca si e itamaken i bas suhu 62°C selama 72 jam. Gunaken ultramikrotom (Leica Microsystems, UC6) ras piso berlian (Diatome, Biel, Swiss) guna motong bagin si ultratipis 70 nm, ras nodai alu uranil asetat 1,5% selama 15 menit i bas suhu 37°C, ras nodai alu larutan timah sitrat 4 menit. Mikrograf elektron e ibuat alu make mikroskop elektron transmisi JEM-2100 Plus (JEOL) si ilengkapi alu perangkat lunak Camera OneView 4K 16-bit (Gatan) ras perangkat lunak DigitalMicrograph (Gatan). Guna analisis, mikrograf elektron idatken alu zoom digital 5000× ntah pe 10.000×.
Analisis morfologis ibas mitokondria nari. Bagi kerina analisis, kontur mitokondria individu igarisken secara manual i bas gambar digital alu make perangkat lunak ImageJ. Parameter morfologis si berbeda-beda si ianalisa. Kepadaten mitokondria ikataken alu persentase si idatken alu mbagi total luas mitokondria tiap sel ras luas sitoplasma (luas sitoplasma = luas sel-luas inti sel) × 100. Kebulaten mitokondria ihitung alu rumus [4π∙2(luas)]./perimeter. Morfologi ista mitokondria ianalisa ras ibagi jadi dua kategori (“tubular” ras “lepuh”) sue ras bentuk utamana.
Analisis jumlah autofagosom/lisosom ras kepadatenna. Gunaken perangkat lunak ImageJ guna secara manual nggambarken kontur tiap autofagosom/lisosom ibas gambar digital. Luas autofagosom/lisosom inyatakan sebage persentase si ihitung alu mbagi total luas struktur autofagosom/lisosom tiap sel ras luas sitoplasma (luas sitoplasma=luas sel-luas inti)×100. Kepadaten autofagosom/lisosom ihitung alu mbagi jumlah total ras jumlah struktur autofagosom/lisosom per sel (ibas segi luas sitoplasma) (luas sitoplasma = luas sel-luas inti).
Pelabelan guna pembagian akut ras persiapen sampel. Bagi percobaan si perlu pelabelen glukosa, pindahken irisen otak akut ku ruang pra-inkubasi, si iisi karbon jenuh (95% O2 ras 5% CO2), Ca2 + ACSF si tinggi (NaCl 125,0 mM, KCl 2,5 mM, natrium m3O fosfat 1,25 mM, Natrium fosfat 1,25 mM. 25,0 mM d-glukosa, 1,0 mM CaCl 2 ras 2,0 mM MgCl 2, isesuaiken ras pH 7,4 ras 310 seh ku 320 mOsm), i ja glukosa eme 13 C 6- Penggantin glukosa (Eurisotop, nomor katalog63-1). Bagi percobaan si perlu pelabelen piruvat, ipindahken irisen otak akut ku Ca2 + ACSF si lebih tinggi (NaCl 125,0 mM, KCl 2,5 mM, penyangga natrium fosfat 1,25 mM, NaHCO3 25,0 mM, Ad.2M d-glukosa 25,0 mM ras 1). MgCl2, isesuaiken ku pH 7,4 ras 310 seh ku 320mOsm), janah itambahken 1-[1-13C]piruvat 1mM (Eurisotop, nomor katalog CLM-1082). Inkubasi bagin-bagin e 90 menit i bas suhu 37°C. I bas pendungi percobaan, bagin-bagin e icuci alu pedas alu larutan berair (pH 7,4) si mengandung amonium karbonat 75 mM, kenca si e i homogenken i bas 40:40:20 (v:v:v) asetonitril (ACN): metanol: lau. Kenca bagin-bagin e i inkubasi i datas es selama 30 menit, sampel e i sentrifugasi alu 21.000 g selama 10 menit i bas suhu 4°C, janah supernatan si bening e i keringken i bas konsentrator SpeedVac. Pelet metabolit si enggo kering si ihasilken isimpan i bas suhu -80°C seh i analisis.
Analisis kromatografi cair-spektrometri massa 13 asam amino si lit label C. Guna analisis kromatografi cair-spektrometri massa (LC-MS), pelet metabolit isuspensi mulihi ku bas 75μl lau kelas LC-MS (Honeywell). Kenca sentrifugasi 21.000 g selama 5 menit i bas suhu 4°C, 20 μl supernatan si enggo iklarifikasi ipake guna analisis fluks asam amino, sedangken sisa ekstrak minter ipake guna analisis anion (nen i teruh). Analisis asam amino ilakoken alu make protokol derivatisasi benzoil klorida si enggo ituriken sebelumna (55, 56). I bas langkah si pemena, 10 μl natrium karbonat 100 mM (Sigma-Aldrich) itambahken ku 20 μl ekstrak metabolit, kenca si e 10 μl benzoil klorida 2% (Sigma-Aldrich) itambahken ku ACN kelas LC. Sampel e i vortex kentisik kenca si e i sentrifugasi alu 21.000 g selama 5 menit i bas suhu 20°C. Pindahken supernatan si enggo ibersihken ku bas botol autosampler 2 ml alu sisipen kaca kerucut (volume 200 μl). Sampel-sampel e ianalisis alu make sistem LC (Waters) si berkinerja ultra tinggi Acquity iClass si ihubungken ku spektrometer massa presisi resolusi tinggi Q-Exactive (QE)-HF (Orbitrangkap Medan Ultra Tinggi) (Thermo Fisher Scientific). Guna analisis, 2μl sampel turunen isuntikken ku bas kolom silika T3 kekuatan tinggi 100×1,0 mm (Waters) si iisi partikel 1,8μm. Laju alirenna 100μl/min, janah sistem penyangga terdiri ibas penyangga A (10 mM amonium format ras 0,15% asam formik ibas lau) ras penyangga B (ACN). Gradienna eme bagi si tersena i teruh enda: 0%B ibas 0 menit; 0%B. 0 seh ku 15% B i bas 0 seh ku 0,1 menit; 15 seh ku 17% B i bas 0,1 seh ku 0,5 menit; B ibas 17 seh ku 55% ibas 0,5 seh ku 14 menit; B ibas 55 seh ku 70% ibas 14 seh ku 14,5 menit; i bas 14,5 seh ku 70 seh ku 100% B i bas 18 menit; 100% B ibas 18 seh ku 19 menit; 100 seh ku 0% B i bas 19 seh ku 19,1 menit; 0% B ibas 19,1 seh ku 28 menit (55, 56). Spektrometer massa QE-HF beroperasi ibas mode ionisasi positif alu rentang massa m/z (rasio massa/muatan) 50 seh ku 750. Resolusi si iterapken eme 60.000, ras target ion kontrol keuntungen (AGC) si idatken eme 3×106, ras waktu ion milliconds maksimum eme1. Sumber ionisasi elektrospray si ipemanas (ESI) beroperasi ibas tegangan semproten 3,5 kV, suhu kapiler 250°C, aliren udara sarung 60 AU (satuan sewenang-wenang), ras aliren udara bantu 20 AU. 250°C. Lensa S e ipasang ku 60 AU.
Analisis kromatografi anion-MS asam organik si lit labelna 13C. Endapan metabolit si tading (55μl) ianalisis alu make sistem kromatografi ion Dionex (ICS 5000+, Ilmiah Termo Fisher) si ihubungken ku spektrometer massa QE-HF (Ilmiah Termo Fisher). Singkatna, 5μl ekstrak metabolit isuntikken ku bas kolom Dionex IonPac AS11-HC si ilengkapi alu HPLC (2 mm×250 mm, ukuren partikel 4μm, Thermo Fisher Scientific) alu mode loop parsial push-in alu rasio pengisian 1. 4μm, Termo Nelayan Ilmiah). Suhu kolom ijaga 30°C, janah autosampler ibahan 6°C. Gunaken kartrid kalium hidroksida si isediaken alu lau deionisasi guna menghasilken gradien kalium hidroksida arah generator eluen. Pemisahan metabolit alu laju aliren 380μl/menit, alu nerapken gradien si tersena i teruh enda: 0 seh ku 3 menit, KOH 10 mM; 3 seh 12 menit, 10 seh 50 mM KOH; 12 seh ku 19 menit, 50 seh ku 100 mM KOH; 19 seh ku 21 menit , 100 mM KOH; 21 seh ku 21,5 menit, 100 seh ku 10 mM KOH. Kolom e i seimbangken mulihi i teruh KOH 10 mM selama 8,5 menit.
Metabolit si ielusi igabungken ras aliren suplemen isopropanol 150μl/min kenca kolom kenca si e iarahken ku spektrometer massa resolusi tinggi si beroperasi i bas mode ionisasi negatif. MS enda memantau rentang massa mulai m/z 50 seh ku 750 alu resolusi 60.000. AGC ibahan 1×106, janah waktu ion maksimal ijaga 100 ms. Sumber ESI si ipemanas e ioperasiken alu tegangan semproten 3,5 kV. Pengaturan sumber ion si deban eme: suhu kapiler 275°C; aliren gas sarung, 60 AU; aliren gas bantu, 20 AU ibas suhu 300°C, ras pengaturen lensa S ku 60 AU.
Analisis data metabolit si lit labelna 13C. Gunakenlah perangkat lunak TraceFinder (versi 4.2, Termo Fisher Ilmiah) guna analisis data rasio isotop. Identitas tep-tep senyawa iverifikasi alu senyawa acuan si banci iandalken ras ianalisis secara mandiri. Guna ngelakoken analisis pengayaan isotop, luas kromatogram ion si iekstraksi (XIC) i bas tep-tep isotop 13C (Mn) iekstraksi i bas [M + H] + nari, i ja n eme nomor karbon senyawa sasaran, ipake guna nganalisis asam amino ntah pe [ MH] + ipake guna nganalisis anion. Akurasi massa XIC kurang lima bagin per juta, janah akurasi RT 0,05 menit. Analisis pengayaan ilakoken alu menghitung rasio tiap isotop si terdeteksi ras jumlah kerina isotop senyawa si sesuai. Rasio-rasio enda ibereken sebage nilai persentase man tep-tep isotop, janah hasilna ikataken sebage pengayaan persen molar (MPE), bagi si enggo ituriken sebelumna (42).
Pelet neuron si enggo beku e i homogenken i bas metanol 80% (v/v) si dingin bagi es, i vortex, janah i inkubasi i bas suhu -20°C selama 30 menit. Vortex sampel e mulihi ras aduk ibas suhu +4°C selama 30 menit. Sampel isentrifugasi ibas suhu 21.000 g selama 5 menit ibas suhu 4°C, kenca si e supernatan si ihasilken ikumpulken ras ikeriken alu make konsentrator SpeedVac ibas suhu 25°C guna analisis selanjutna. Bagi si enggo ituriken ndai, analisis LC-MS ilakoken nandangi asam amino sel-sel si enggo ipilih. Alu make TraceFinder (versi 4.2, Termo Fisher Ilmiah), analisis data ilakoken alu make massa monoisotop tiap senyawa. Normalisasi kuantil data metabolit ilakoken alu make paket perangkat lunak praprosesCore (57).
Persiapen si ibahan. Tikus e pedas i bius alu karbon dioksida ras igunting takalna, otakna pedas ibuat i bas takalna nari, janah piso si ergetar si isina es (HM-650 V, Thermo Fisher Scientific, Walldorf, Jerman) ipake guna motongsa jadi 300 seh ku 375 μm karbon seksi O5d. CO2) Ca2 + ACSF si rendah (NaCl 125,0 mM, KCl 2,5 mM, penyangga natrium fosfat 1,25 mM, NaHCO3 25,0 mM, d-glukosa 25,0 mM, CaCl2 1,0 mM ras Adju 6,0 mM MgCl372. mOsm). Pindahken irisen otak si idatken ku ruangen si mengandung Ca2 + ACSF si lebih tinggi (NaCl 125,0 mM, KCl 2,5 mM, penyangga natrium fosfat 1,25 mM, NaHCO3 25,0 mM, d-glukosa 25,0 mM pH42l ras Ca32 mM 4,0 mM. ras 310 seh ku 320 mOsm). Simpanlah irisen e 20 seh ku 30 menit gelah banci iulihken ope denga irekam.
rekaman si lit. Panggung mikroskop si ilengkapi alu ruang rekaman si tetap ras lensa objektif immersi lau 20x (Scientifica) ipake guna kerina rekaman. Sel-sel Purkinje si ianggap itandai alu (i) ukuren kula, (ii) ingan anatomi otak kecil, ras (iii) ekspresi gen reporter mtYFP si berpendar. Pipet tambalen si tahan ujungna 5 seh ku 11 megohm itarik ndarat alu kapiler kaca borosilikat (GB150-10, 0,86 mm×1,5 mm×100 mm, Produk Ilmu Pengetahuan, Hofheim, Jerman) ras pipet horisontal Instruments (P-1000), No. Kerina rekaman ilakoken alu penguat penjepit tambalen npi ELC-03XS (npi elektronik GmbH, Tam, Jerman), si ikendaliken alu perangkat lunak Signal (versi 6.0, Elektronik Cambridge, Cambridge, Inggris). Percobaan e icatat alu tingkat pengambilan sampel 12,5 kHz. Sinyal e isaring alu dua filter Bessel si short-pass alu frekuensi cutoff masing-masing 1,3 ras 10 kHz. Kapasitas membran ras pipet e iganti alu rangkaian kompensasi si make penguat. Kerina percobaan ilakoken alu kendali kamera Orca-Flash 4.0 (Hamamatsu, Gerden, Jerman), si ikendaliken alu perangkat lunak Hokawo (versi 2.8, Hamamatsu, Gerden, Jerman).
Rutin konfigurasi ras analisis seluruh sel. Segera ope ngerekam, isi pipet alu larutan internal si mengandung zat-zat berikut: KCl 4,0 mM, NaCl 2,0 mM, EGTA 0,2 mM, kalium glukonat 135,0 mM, Hepes 10,0 mM, Gufano.TPG5g 4,0 mM (ATP.TPG5g) (Na) ras kreatinin fosfat 10,0 mM isesuaiken ku pH 7,25, janah tekanan osmotik 290 mOsm (sukrosa). Minter kenca ibahan gaya 0 pA guna ngeretak membran, potensi membran istirahat iukur. Resistensi masuken e iukur alu nerapken arus hiperpolarisasi -40, -30, -20, ras -10 pA. Ukurilah belinna respon tegangan ras pakelah hukum Ohm guna ngitung resistansi masuken. Aktivitas spontan icatat ibas penjepit tegangan selama 5 menit, janah sPSC iidentifikasi ras iukur ibas Igor Pro (versi 32 7.01, WaveMetrics, Danau Oswego, Oregon, AS) alu make skrip pengenalan setengah otomatis. Kurva IV ras arus steady-state iukur alu menjepit baterai ibas potensi si berbeda (mulai -110 mV) ras nambahi tegangan ibas langkah 5 mV. Produksi AP iuji alu nerapken arus depolarisasi. Jepit sel e ibas -70 mV sambil nerapken pulsa arus depolarisasi. Sesuaiken ukuren langkah tiap unit rekaman secara terpisah (10 seh ku 60 pA). Hitunglah frekuensi AP maksimal alu ngitung secara manual lonjaken pulsa si erbahanca frekuensi AP si meganjangna. Ambang AP i analisis alu make turunen si peduaken ibas pulsa depolarisasi si pemena memicu sada ntah pe lebih AP.
Konfigurasi ras analisis tambalen si erlubang. Ilakoken rekaman tambalen si erlubang alu make protokol standar. Gunaken pipet bebas ATP ras GTP si la lit bahan-bahanna: glukonat K 128 mM, KCl 10 mM, Hepes 10 mM, EGTA 0,1 mM ras MgCl2 2 mM, janah sesuaiken ku pH 7,2 (pake KOH). ATP ras GTP ihilangkan ibas larutan intraseluler guna mencegah permeabilitas membran sel si la terkendali. Pipet tambal e iisi alu larutan internal si mengandung amfoterisin (kira-kira 200 seh 250μg/ml; G4888, Sigma-Aldrich) guna ndatken cataten tambal si enggo itebuk. Amfoterisin ilarutken ibas dimetil sulfoksida (konsentrasi akhir: 0,1 seh ku 0,3%; DMSO; D8418, Sigma-Aldrich). Konsentrasi DMSO si ipake labo lit pengaruhna si signifikan nandangi neuron si ipelajari. Ibas proses punching, resistansi saluren (Ra) terus ipantau, janah percobaan ibenaken kenca amplitudo Ra ras AP stabil (20-40 menit). Aktivitas spontan iukur ibas penjepit tegangan ras/ntah pe arus selama 2 seh ku 5 menit. Analisis data ilakoken alu make Igor Pro (versi 7.05.2, WaveMetrics, AS), Excel (versi 2010, Perusahaan Microsoft, Redmond, AS) ras GraphPad Prism (versi 8.1.2, Perangkat Lunak GraphPad Inc. Amerika Serikat). Guna meteh AP si spontan, ipake me plug-in NeuroMatic v3.0c IgorPro. Otomatis identifikasi AP alu make ambang batas si enggo itentuken, si isesuaiken secara pribadi guna tiap cataten. Alu make interval lonjaken, tentuken frekuensi lonjaken alu frekuensi lonjaken instan maksimal ras frekuensi lonjaken rata-rata.
PN isolasi. Alu beradaptasi ras protokol si enggo iterbitken sebelumna, PNs imurniken i bas otak tikus nari i bas tahap si enggo itentuken (58). Singkatna, otak si kitik ibedah ras i giling i bas media disosiasi si dingin bagi es [tanpa HBSS Ca2+ ras Mg2+, itambahi alu glukosa 20 mM, penisilin (50 U/ml) ras streptomisin (0,05 mg/ ml) (0,05 mg/ ml) ( kenca si e icerna · media e i bas mgSS1, papal1. / ml), papain (16 U / ml) ras deoksiribonuklease I (DNase I; 0,1 mg/ml)] Irawat 30 menit i bas suhu 30°C. Pertama cuci jaringan ibas media HBSS si mengandung lendir telur (10 mg/ml), BSA (10 mg/ml) ras DNase (0,1 mg/ml) ibas suhu kamar guna mencegah pencernaan enzimatik, jenari ibas media HBSS si mengandung glukosa 20 mM Alu lembut giling ibas HBmilin5 (0,05 mg/ml) ras DNase (0,1 mg/ml) mpedarat sel-sel si sada. Suspensi sel si ihasilken isaring alu saringan sel 70μm, kenca si e sel-sel e ipelet alu sentrifugasi (1110 rpm, 5 menit, 4°C) ras isuspensi mulihi i bas media penyortiren [HBSS, itambahi alu glukosa 20 mM, 20% stremilin janin sapi) Serum, 20% stremilin janin). (0,05 mg/ml)]; evaluasi daya tahan sel alu propidium yodida ras menyesuaiken kepadaten sel ku 1×106 seh ku 2×106 sel/ml. Sope sitometri aliren, suspensi e isaring alu saringan sel 50 μm.
Sitometer alirenna. Penyortiren sel ilakoken ibas suhu 4°C alu make mesin FACSAria III (BD Biosains) ras perangkat lunak FACSDiva (BD Biosains, versi 8.0.1). Suspensi sel e iurutken alu make nozzle 100 μm alu tekanan 20 psi alu kecepatan ~2800 peristiwa/detik. Erkiteken kriteria gerbang tradisional (ukuren sel, diskriminasi bimodal, ras karakteristik hamburen) la banci memastikan isolasi PN si benar i bas jenis sel si deban nari, maka strategi gerbang itetapken erpalasken perbandingen langsung intensitas YFP ras autofluoresensi i bas mitoYFP+ ​​ras mitoYFP − kontrol MitoYFP. YFP tereksitasi alu menyinari sampel alu garis laser 488 nm, janah sinyal e ideteksi alu make filter band pass 530/30 nm. I bas tikus mitoYFP+, gegeh relatif gen reporter Rosa26-mitoYFP pe ipake guna mbedaken badan saraf ras pecahen akson. 7-AAD i eksitasi alu laser kuning 561 nm ras ideteksi alu filter bandpass 675/20 nm guna ngeluari sel-sel si enggo mate. Guna misahken astrosit ibas waktu si seri, suspensi sel iwarnai alu ACSA-2-APC, kenca si e sampel i iradiasi alu garis laser 640 nm, ras filter bandpass 660/20 nm ipake guna mendeteksi sinyal.
Sel-sel si enggo ipepulung ipelet alu sentrifugasi (1110 rpm, 5 menit, 4°C) ras isimpan i bas suhu -80°C seh ipakena. Tikus Mfn2cKO ras anak-anakna si lit i bas litterna iklasifikasiken i bas wari si seri guna meminimalken variabilitas prosedural. Penyajian ras analisis data FACS ilakoken alu make perangkat lunak FlowJo (FlowJo LLC, Ashland, Oregon, AS).
Bagi si enggo ituriken ndai (59), PCR real-time ipake guna mengisolasi DNA ibas neuron si iurutken guna kuantifikasi mtDNA selanjutna. Linieritas ras sensitivitas ambang batas awalna iuji alu ndalanken qPCR ku jumlah sel si berbeda. Singkatna, kumpulken 300 PN ibas penyangga lisis si terdiri ibas tris-HCl 50 mM (pH 8,5), EDTA 1 mM, Tween 20 0,5% ras proteinase K (200 ng/ml) ras iinkubasi ibas suhu 55°C 120 menit. Sel-sel e i inkubasi selanjutna i bas suhu 95°C selama 10 menit guna memastikan inaktivasi lengkap proteinase K. Alu make probe TaqMan (Thermo Fisher) si khusus man mt-Nd1, mtDNA iukur alu PCR semi-kuantitatif i bas sistem PCR Fificmosher Waktu Nyata 7900HT (Ther). Ilmu pengetahuan, nomor katalog Mm04225274_s1), mt-Nd6 (Ilmiah Termo Nelayan, nomor katalog AIVI3E8) ras 18S (Ilmiah Nelayan Termo, nomor katalog Hs99999901_s1) gen.
Persiapen sampel proteom. Alu mpemanas larutan i bas suhu 95°C selama 10 menit ras sonikasi, i bas penyangga lisis [6 M guanidin klorida, 10 mM tris (2-karboksietil) fosfin hidroklorida, 10 mM kloroasetamida ras 100 mM tris- Lise pelet i bas neuron beku]. I bas Bioruptor (Diagenode) selama 10 menit (30 detik denyut nadi/30 detik masa jeda). Sampel e i encerken 1:10 ibas tris-HCl 20 mM (pH 8,0), icampur ras 300 ng emas tripsin (Promega), janah i inkubasi semalam ibas suhu 37°C gelah tercapai pencernaan si lengkap. I bas wari si peduaken, sampel e isentrifugasi alu 20.000 g selama 20 menit. Supernatan e i encerken alu asam formik 0,1%, janah larutan e i desalt alu StageTips si ibahan sendiri. Sampel e i keringken ibas alat SpeedVac (konsentrator Eppendorf ditambah 5305) ibas suhu 45°C, kenca si e peptida e isuspensi ibas asam formik 0,1%. Kerina sampel isikapken secara serentak alu kalak si seri. Guna nganalisis sampel astrosit, 4 μg peptida si enggo iuras ibereken label alu tanda massa tandem (TMT10plex, nomor katalog 90110, Thermo Fisher Ilmiah) alu rasio peptida ras reagen TMT 1:20. Guna pelabelan TMT, 0,8 mg reagen TMT isuspensi mulihi ku bas 70 μl ACN anhidrat, janah peptida si enggo kering e irekonstitusi jadi 9 μl TEAB 0,1 M (trietilamonium bikarbonat), ku ja itambahken 7 μl reagen TMT i bas ACN. Konsentrasi si lit eme 43,75%. Kenca 60 menit inkubasi, reaksi e ipadamken alu 2 μl hidroksilamin 5%. Peptida si enggo ilabeli ipepulung, ikeringken, isuspensi mulihi i bas 200μl asam formik (FA) 0,1%, ibagi jadi dua, kenca si e i-desalt alu make StageTips si ibahan sendiri. Alu make kromatograf cair berkinerja ultra tinggi UltiMate 3000 (kromatograf cair berkinerja ultra tinggi UltiMate 3000), salah sada i bas dua bagin e ifraksiken i bas kolom kromatografi Acquity 1mm x 150mm si iisi alu partikel C18 130Å1,7μm (NoWaters, katalog150). Termo Nelayan Ilmiah). Pisahken peptida alu laju aliren 30μl/min, pisahken ibas 1% seh ku 50% penyangga B selama 85 menit alu gradien bertahap 96 menit, ibas 50% seh ku 95% penyangga B selama 3 menit, kenca si e 8 menit guna 95 % Penyangga B; Penyangga A eme 5% ACN ras 10 mM amonium bikarbonat (ABC), janah penyangga B eme 80% ACN ras 10 mM ABC. Pepulung pecahen tiap 3 menit ras gabungken jadi dua kelompok (1 + 17, 2 + 18, rsd.) ras keriken ibas sentrifugal vakum.
Analisis si ibahan alu LC-MS/MS. Guna spektrometri massa, peptida (nomor r119.aq) ipisahken i bas kolom analisis PicoFrit si diameterna 25 cm, diameter dalamna 75 μm (lensa objektif si mbaru, nomor bagian PF7508250) si ilengkapi alu bahan ReproSil-Purse 1,9 μm. 1200 (Ilmiah Nelayan Termo, Jerman). Kolom e ijaga i bas suhu 50°C. Penyangga A ras B eme 0,1% asam formik ibas lau ras 0,1% asam formik ibas 80% ACN. Peptida ipisahken ibas penyangga B 6% seh ku 31% selama 65 menit ras ibas penyangga B 31% seh ku 50% selama 5 menit alu gradien 200 nl/min. Peptida si enggo ielusi e ianalisis alu spektrometer massa Fusi Orbitrap (Thermo Fisher Ilmiah). Pengukuren m/z prekursor peptida ilakoken alu resolusi 120.000 ibas kisaran 350 seh ku 1500 m/z. Alu make energi tabraken si enggo inormalisasi 27%, prekursor si megegehna alu keadaan muaten 2 seh ku 6 ipilih guna pembelahen dissosiasi perangkap C (HCD) si berenergi tinggi. Waktu siklusna ibahan 1 s. Nilai m/z fragmen peptida iukur ibas perangkap ion alu make target AGC si kitikna 5×104 ras waktu suntikan maksimal 86 ms. Kenca enggo fragmentasi, prekursor itamaken ibas daftar pengecualian dinamis selama 45 s. Peptida si lit label TMT ipisahken i bas kolom PepMap Acclaim si belangna 50 cm, 75 μm (Thermo Fisher Scientific, nomor katalog 164942), janah spektrum migrasi ianalisis i bas spektrometer massa Orbitrap Lumos Tribrid (spektrometer massa Tribrid Orbitrap Lumos (Thermo Fisher Scientific equimmetric tinggi) (FAIMS) peralatan (Thermo Fisher Scientific) beroperasi ibas dua tegangan kompensasi −50 ras −70 V. MS3 si ipilih erpalasken prekursor sinkronisasi ipake guna pengukuren sinyal ion laporen TMT. Pemisahan peptida ilakoken ibas EASY-nLC 1200, alu make elusi gradien linier 90%, alu konsentrasi penyangga 6% seh ku 31%; penyangga A eme 0,1% FA, ras penyangga B eme 0,1% FA ras 80% ACN. Kolom analisis e ioperasiken ibas suhu 50°C. Gunaken FreeStyle (versi 1.6, Thermo Fisher Ilmiah) guna mbagi file asli rikutken tegangan kompensasi FAIMS.
Identifikasi ras kuantifikasi protein. Alu make mesin pencari Andromeda si terpadu, data aslina ianalisis alu make MaxQuant versi 1.5.2.8 (https://maxquant.org/). Selain uruten Cre rekombinase ras YFP si idatken i bas Aequorea victoria nari, spektrum fragmen peptida idarami uruten kanonik ras uruten isoform proteom acuan tikus (ID Proteom UP000000589, si iunduh i bas UniProt i bas bulan Mei 2010). Oksidasi metionin ras asetilasi N-terminal protein itetapken jadi modifikasi variabel; metilasi sistein karbamoil itetapken jadi modifikasi si tetap. Parameter pencernaan ibahan jadi “spesifisitas” ras “tripsin/P”. Jumlah peptida ras peptida silet si ipake guna identifikasi protein si minimal eme 1; jumlah peptida si unik minimal eme 0. Ibas kondisi pencocoken peta peptida, tingkat identifikasi protein eme 0,01. Opsi “Peptida si Peduaken” enggo iaktifken. Gunaken pilihen “cocok antar lari” guna mindahken identifikasi si berhasil antar file asli si berbeda. Gunaken LFQ rasio minimal hitungen 1 guna kuantifikasi bebas label (LFQ) (60). Intensitas LFQ isaring sekurang-kurangna dua nilai si sah i bas sekurang-kurangna sada kelompok genotipe i bas tep-tep titik waktu, janah i ekstrapolasi i bas distribusi normal alu lebar. 0,3 ras pindah ku teruh 1,8. Gunaken platform komputasi Perseus ras R guna nganalisis hasil LFQ. Uji t moderat dua arah i bas paket perangkat lunak limma nari ipake guna analisis ekspresi diferensial (61). Analisis data eksploratif ilakoken alu make ggplot, FaktoMineR, faktoekstra, GGally ras pheatmap. Data proteomik berbasis TMT i analisis alu make MaxQuant versi 1.6.10.43. Ndarami data proteomik mentah i bas database proteomik manusia UniProt nari, si iunduh i bas bulan September 2018. Analisis e termasuk faktor koreksi kemurnian isotop si isediaken pabrik. Pake limma ibas R guna analisis ekspresi diferensial. Data asli, hasil pencarian basis data, ras alur kerja ras hasil analisis data kerina isimpan i bas aliansi ProteomeXchange arah repositori mitra PRIDE alu pengidentifikasi kumpulen data PXD019690.
Anotasi fungsional mpebayak analisis. Alat Analisis Jalur Kecerdasan (QIAGEN) ipake guna nentuken kebayaken istilah anotasi fungsional data si itetapken i bas 8 minggu (Gambar 1). Singkatna, daftar protein kuantitatif si idatken arah analisis data LC-MS/MS (spektrometri massa tandem) ipake alu kriteria filter berikut: Mus musculus ipilih jadi spesies ras latar belakang, janah kategori ncidahken nilai P si isesuaiken Benjamini guna pengayaan 0,05 ntah pe si lebih rendah ianggap signifikan. Bagi grafik enda, lima kategori kelebihen si pemena i bas tep-tep kluster erpalasken nilai P si isesuaiken ituriken. Alu make uji t si erbage-bage, alu make program dorongen linier dua tahap Benjamini, Krieger, ras Yekutieli (Q = 5%), analisis ekspresi protein perdalanen waktu ilakoken nandangi kandidat penting si iidentifikasi i bas tep-tep kategori, janah tep-tep baris ianalisis secara terpisah. Labo perlu iadopsi SD si konsisten.
Guna membandingken hasil penelitian enda ras database si enggo iterbitken ras menghasilken diagram Venn ibas Gambar 1, igabungken kami daftar protein kuantitatif ras anotasi MitoCarta 2.0 (24). Gunaken alat online Gambarken Diagram Venn (http) guna erbahan diagram e.
Adi atendu meteh terbuen kerna prosedur statistik si ipake guna analisis proteomik, banci idahndu i bas bagin si cocok i bas Bahan ras Cara. Bagi kerina percobaan si deban, informasi si rinci banci idatndu i bas legenda si sesuai. Adi la lit si deban si itentuken, kerina data ikataken rata-rata ± SEM, janah kerina analisis statistik ilakoken alu make perangkat lunak GraphPad Prism 8.1.2.
Guna bahan tambahen guna artikel enda, banci idahndu i bas http://advances.sciencemag.org/cgi/isi/lengkap/35/6/eaba8271/DC1.
Enda me sada artikel akses terbuka si ibagiken alu ketentuan Lisensi Atribusi-Non-Komersial Creative Commons, si banci ipake, ibagiken ras ireproduksi i bas media kai pe, asalken penggunaan akhir labo guna keuntungen komersial ras premisna eme maka karya aslina benar. Referensi.
Cataten: Kami hanya mindo gelah iberekenndu alamat emailndu gelah kalak si irekomendasikenndu ku halaman e meteh maka atendu idahna email e janah labo spam. Labo itangkap kami alamat email si lit.
Penungkunen enda ipake guna nguji kam pengunjung ntah lang ras mencegah pengirimen spam otomatis.
I bas sada paksa, lit piga-piga kalak si gelarna E. Motori, I. Atanassov, SMV Kochan, K. Folz-Donahue, V. Sakthivelu, P. Giavalisco, N. Toni, J. Puyal, N.-G. Larson
Analisis proteomik neuron si la erfungsi ncidahken maka program metabolisme iaktifken guna ngalaken degenerasi saraf.
I bas sada paksa, lit piga-piga kalak si gelarna E. Motori, I. Atanassov, SMV Kochan, K. Folz-Donahue, V. Sakthivelu, P. Giavalisco, N. Toni, J. Puyal, N.-G. Larson
Analisis proteomik neuron si la erfungsi ncidahken maka program metabolisme iaktifken guna ngalaken degenerasi saraf.
©2020 Asosiasi Amerika guna Kemajun Ilmu Pengetahuan. kerina hak cipta lit i bas ia. AAAS eme mitra HINARI, AGORA, OARE, KOOR, JAMSS, Ref Silang ras PENGHITUNG. Kemajun Ilmu Pengetahuan ISSN 2375-2548.