Penyortiren protein ibas jalur sekresi penting guna njaga kompartementalisasi sel ras homeostasis. Selain penyortiren si imediasi cangkang, peran lipid ibas penyortiren kinesin ibas proses transportasi sekresi eme sada penungkunen dasar si enggo ndekah si lenga terjabap. I jenda, ilakoken kami pencitraan waktu nyata resolusi tinggi multiwarna serentak 3D guna mbuktiken secara vivo maka protein si mbaru isintesis si imobilisasi glikosilfosfatidilinositol alu moieties lipid keramida si seh kal gedangna ikelompokken ras iklasifikasiken jadi endoplasma khusus Net usembraneme situs keluar si, eme. Selain si e, icidahken kami maka gedang rantai seramida i bas membran retikulum endoplasma penting kal guna selektifitas penyortiren enda. Studi kami mereken bukti langsung in vivo si pemena guna mengklasifikasiken kargo protein erpalasken gedang rantai lipid ku situs ekspor selektif i bas jalur sekresi.
I bas sel eukariotik, protein si isintesis i bas retikulum endoplasma (ER) kenca si e iurutken sanga iangkut arah jalur sekresi guna ibereken ku tujun seluler si tepat (1). Selain penyortiren si imediasi mantel, enggo ndekah i spekulasiken maka lipid tertentu pe banci berfungsi sebage titik keluar selektif alu mengkelompokkenca ku domain membran tertentu si protein tertentu (2-5). Tapi, tetap denga kurang bukti in vivo langsung guna mbuktiken kemungkinan mekanisme berbasis lipid enda. Guna ndungi masalah dasar enda, ipelajari kami i bas ragi uga protein berlabuh glikosilfosfatidilinositol (GPI) (GPI-AP) secara berbeda iekspor i bas ER nari. GPI-AP eme erbage-bage protein permukaan sel si terhubung ras lipid ( 6, 7). GPI-AP eme protein si isekresiken si melekat ku selebaran luar membran plasma arah bagian glikolipid (jangkar GPI). Ialokenna jangkar GPI sebage modifikasi pasca terjemahen si konservatif i bas lumen ER (8). Kenca enggo melekat, GPI-AP lewat arah aparat Golgi (5, 9) i bas ER nari ku membran plasma. Kehadiren jangkar GPI erbahanca GPI-AP iangkut secara terpisah ras protein si isekresiken transmembran (termasuk protein membran plasma si deban) i sepanjang jalur sekresi (5, 9, 10). I bas sel ragi, GPI-AP ipisahken i bas protein si deban si isekresiken i bas retikulum endoplasma, kenca si e ikemas jadi vesikel si unik si ibaluti alu kompleks protein lapisen II (COPII) (6, 7). Penentu proses klasifikasi enda ibas proses ekspor ER la jelas, tapi lit spekulasi maka mekanisme enda mungkin membutuhken lipid, khususna remodeling struktural porsi lipid jangkar GPI (5, 8). I bas ragi, remodeling lipid GPI ibenaken minter kenca GPI e melekat, janah i bas melala kasus, e erbahanca seramida terikat ku asam lemak jenuh berantai panjang 26 karbon (C26:0) (11, 12). C26 seramida eme seramida utama si ihasilken sel ragi sedekah enda. I sintesis ibas ER janah sebagian besar i ekspor ku aparat Golgi arah vesikel COPII (13). Ekspor ER GPI-AP secara khusus membutuhken sintesis seramida si terus erdalan (14, 15), janah i bas gilirenna, konversi seramida jadi inositol fosfat seramida (IPC) i bas aparat Golgi tergantung ku sintesis jangkar GPI (16). Studi biofisika alu membran buaten enggo ncidahken maka seramida rantai asil si seh kel gedangna banci ersada guna membentuk domain si tersusun alu sifat fisik si unik (17, 18). Data enda mabai ku hipotesis maka C26 seramida ras GPI-AP ras C26 seramida make sifat fisikna guna ersada jadi daerah si teratur ntah pe daerah i bas lingkungen lipid membran ER si relatif kacau. Terutama terdiri ibas gliserolipid si gendek ras la jenuh (C16:1 ras C18:1) (19, 20). Daerah-daerah enda secara selektif i fokusken ku situs keluar ER (ERES) tertentu, i ja seramida ras GPI-AP berbasis seramida banci bersama-sama iangkut ku Golgi i bas vesikel COPII si khusus si seri (5).
I bas penelitian enda, enggo langsung iuji kami mekanisme berbasis lipid enda alu make mikroskop pencitraan waktu nyata konfokal super-resolusi (SCLIM), si merupaken teknik mikroskop mutakhir si banci secara serentak mengamati protein si berlabel fluoresensi Sel si telu warna ras telu dimensi lit lipelu si tinggi resolusina ras (3D) . (21, 22).
Pertama-tama iterapken kami teknologi SCLIM guna lebih mendefinisiken kuga GPI-AP normal ras kelompok seramida C26 isaring arah protein si isekresiken transmembran kenca ndarat i bas ER i bas S. cerevisiae. Guna mereksa klasifikasi ER, ipake kami sistem genetik si banci langsung memvisualisasiken kargo si mbaru isintesis masuk ku ERES in vivo (7, 23). Sebage muaten, ipilih kami GPI-AP Gas1 berbasis seramida C26 si ilabeli alu protein neon hijau (GFP) ras protein si isekresiken transmembran Mid2 si ilabeli alu protein neon inframerah dekat (iRFP), si duana menargetkan membran plasma (24-26). I bas mutan sec31-1 si sensitif nandangi suhu, dua muaten enda iekspresiken i teruh promotor si banci iinduksi galaktosa ras penanda ERES si konstitutif. I bas suhu si ekstrim (37°C), erkiteken mutasi sec31-1 mpengaruhi fungsi komponen lapisen COPII Sec31 guna menghambat perkecambahan COPII ras ekspor ER, kargo si mbaru isintesis terkumpul i ER (23). Kenca enggo dingin ku suhu si rendah (24°C), sel-sel mutan sec31-1 e pulih i bas daerah sekresi nari, janah muaten sintetis si mbaru si terkumpul mulai iekspor i bas ER nari. Visualisasi CLIM ncidahken maka sebagian besar Gas1-GFP ras Mid2-iRFP si mbaru isintesis tetap terkumpul i bas ER sel mutan sec31-1 kenca i inkubasi i bas suhu 37°C kenca si e i lepasken i bas suhu 24°C selama 5 menit (Gambar 1). Erkiteken Mid2-iRFP tersebar i bas kerina membran ER, janah Gas1-GFP terkonsentrasi ras terkumpul i bas daerah membran ER si la berkelanjuten, maka distribusina tuhu-tuhu berbeda (Gambar 1, A seh ku C ras Film S1). Selain si e, bagi si teridah ibas gambar 1D, gugus Gas1-GFP la lit Mid2-iRFP. Hasil enda ncidahken maka GPI-AP ras protein transmembran ipisahken ku daerah membran ER si berbeda awalna. Gugus Gas1-GFP enda berdekatan ras ERES tertentu si ilabeli alu protein lapisen COPII mCherry Sec13 (Gambar 1, E ras F, ras film S1) (23).
Sel sec31-1 ncidahken sekresi si ibahan galaktosa, rantai asil si gedang (C26) keramida GPI-AP Gas1-GFP (GPI-AP, hijau) ras protein transmembran Mid2-iRFP (TMP, biru) ras pelabelen ERES Konstruktif enda Sec13-mCherry, menit, ipindahken ku 24°C, janah icitraken alu SCLIM 5 menit kenca si e. (A seh ku C) ncidahken gambar 2D si mewakili si igabungken ntah pe si sada bidang (A), gambar proyeksi 2D 10 z-section (B) ntah pe gambar belahan sel 3D kargo ras penanda ERES (C). Skala batang 1μm (A ras B). Satuan skalana eme 0,551μm (C). Gas1-GFP terdeteksi i bas daerah ntah pe kluster ER si terpisah, sedangken Mid2-iRFP terdeteksi ras tersebar ku belang-belang membran ER (C). (D) Grafik ncidahken intensitas fluoresensi relatif Gas1-GFP ras Mid2-iRFP i bas gugus Gas1-GFP i sepanjang garis panah si mbentar (kiri). AU, sada unit si sewenang-wenang. (E ras F) mewakili gambar 3D si menggabungken barang ras tanda ERES. Gugus Gas1-GFP si terdeteksi i deher ERES si khusus. Satuan skalana eme 0,551μm. (F) Panah padat si mbentar nandai gugus Gas1-GFP si lit hubungenna ras ERES. Panel tengah ras kanan ncidahken gambar 3D si ipebelang si igabungken ras tampilen si iputar i bas gugus Gas1-GFP si ipilih.
Hubungen spasial si ndeher antara kluster Gas1-GFP ras ERES tertentu ncidahken maka Gas1-GFP banci masuk ku ERES selektif, si berbeda ras selektifitas si ipake Mid2-iRFP guna ndarat i bas ER nari. Guna ngatasi kemungkinan enda, iukur kami rasio ERES guna sada ntah dua barang saja (Gambar 2, A seh ku C). Ijumpai kami maka sebagian besar ERES (70%) lit sada jenis muaten ngenca. Gambar i teruh gambar 2C ncidahken dua contoh khas ERES si hanya Gas1-GFP (Gambar 1) ntah pe Mid2-iRFP saja (Gambar 2). Sebalikna, kurang lebih 20% ERES lit dua muaten si tumpang tindih i bas sada daerah. I je idatken maka piga-piga ERES (10%) lit dua jenis muaten, tapi iisolasi i bas daerah si jelas berbeda. Emaka analisis statistik enda ncidahken maka kenca ER e iekspor, GPI-AP Gas1-GFP ras kargo transmembran Mid2-iRFP ibagi jadi ERES si berbeda (Gambar 2D). Efisiensi penyortiren enda sangat konsisten ras analisis biokimia sebelumna (6) ras penentuan morfologis (7). Banci ka siperdiateken perbahanen muaten si ikarantina masuk ku ERES (Gambar 2E ras Film S2). Gambar 2E ncidahken maka hanya sebagian kitik Gas1-GFP (panel 3) ntah pe Mid2-iRFP (panel 4) si masuk ku ERES arah sada sisi ras terkurung i bas daerah si terpisah. Panel 5 Gambar 2E ncidahken maka Gas1-GFP ras Mid2-iRFP megati lit ibas ERES si seri, tapi masuk ibas sisi si berbeda ras terkonsentrasi ibas daerah si terpisah si mungkin mewakili vesikel COPII si berbeda. Kami pe menegasken maka pemisahan ras klasifikasi si iperhatiken GPI-AP Gas1 berbasis seramida C26 sebage ERES selektif spesifik erkiteken kargo sekresi transmembran si deban, protein membran plasma si itandai GFP Axl2 (27 ), ncidahken perbahanen si seri ras Mid2-iRFP. (Gambar S1 ras Film S3). Axl2-GFP si mbaru isintesis e ibagiken arah membran ER bagi Mid2-iRFP (Gambar S1, A ras B), janah iko-lokalisasi ras Mid2-iRFP i bas sebagian besar ERES (Gambar S1, B seh ku D). Panel 1 ras 2 Gambar 1. S1C ncidahken dua contoh khas ERES i ja dua muaten transmembran tumpang tindih. Ibas kasus-kasus enda, duana barang masuk ku ERES ras-ras (Gambar S1E, Panel 3 ras Film S3).
Sel-sel sec31-1 si mengekspresiken sekresi induksi galaktosa, Gas1-GFP (GPI-AP, hijau) ras Mid2-iRFP (TMP, biru) ras pelabelen ERES konstitutif Sec13-mCherry (ERES, magenta) itamaken i bas suhu 37 Kenca iinkubasi sekresi e i bas °C seh ku °4 menit. blok, ras gambar alu SCLIM kenca 20 menit. (A seh ku C) Gambar proyeksi 2D si mewakili (A; batang skala, 1μm) ntah pe gambar belahan sel 3D (B ras C; satuan skala, 0,456μm) muaten ras 10 bagin z si itandai alu ERES. Panel si arah teruh i bas (B) ras panel i bas (C) ncidahken gambar si enggo iproses guna ncidahken barang-barang si lit i bas ERES (magenta) saja [Gas1-GFP (abu-abu) ras Mid2-iRFP (biru terang)]. (C) Panah terbuka : ERES hanya maba sada muaten (1 seh ku 4). Panah si warnana abu-abu : ERES lit muaten si terpisah (5). Panah padat si mbentar : ERES si lit muatenna si berlokasi bersama. I teruh enda: ERES si sada si ipilih e lit Gas1-GFP (1) ntah pe Mid2-iRFP (2) ngenca. Skala batangna, 100 nm. (D) Kuantifikasi fotomikrograf si ituriken ibas (C). Rata-rata persentase ERES si sada ngenca muatenna (Gas1-GFP ntah pe Mid2-iRFP), muaten si terpisah ras muaten si tumpang tindih. I bas telu percobaan mandiri, n=432 i bas 54 sel. Kesalahen bar = SD. Dua ekor si la erpasangan t uji. *** P = 0,0002 kalak. (E) Gambar 3D ERES si terpilih ibas muaten si ikarantina si itandaina alu (C). Gas1-GFP (hijau) (3) ntah pe Mid2-iRFP (biru) (4) masuk ku ERES (magenta) arah sada sisi janah ibatasi ku daerah si kitik i bas ERES. Maun-maun, duana jenis muaten e masuk ku ERES si seri (5) arah sisi si seri janah terbatas ku daerah si terisolasi i bas ERES e. Skala batangna, 100 nm.
Selanjutna, iuji kami sada hipotesis maka seramida rantai asil si gedang (C26) si lit i bas membran ER mendorong pengkelompoken ras penyortiren spesifik Gas1 jadi ERES selektif. Guna si e, ipake kami strain ragi si imodifikasi GhLag1, i ja dua sintase seramida endogen Lag1 ras Lac1 igantiken alu GhLag1 (homolog Lag1 kapas), si erbahanca lit strain ragi si membran sel Strain Ceramide lebih gendek asangken tipe liar (Gambar 3A) (2). Analisis spektrometri massa (MS) ncidahken maka ibas strain tipe liar, 95% ibas total keramida e seramida rantai si seh kal gedangna (C26), sedangken ibas GhLag1, 85% seramida e seh kal gedangna (C18 ras C16). ), 2% ngenca seramida si seh kal gedangna (C26) rantai keramida. Aminna pe keramida C18 ras C16 merupaken keramida utama si terdeteksi i bas membran GhLag1 sedekah enda, analisis MS pe menegasken maka jangkar GPI Gas1-GFP si iekspresiken i bas strain GhLag1 mengandung keramida C26, si sebanding ras lipid tipe liar. Kualitasna pe seri (Gbr. 3A) (26). Emaka enda ertina enzim remodeling seramida Cwh43 sangat selektif nandangi seramida C26, bagi si teridah ibas gambar 26, ia lebih memilih memasukken jangkar GPI ibas sejumlah kitik seramida C26 ibas strain GhLag1. S2 (29). Amin bage gia, membran sel GhLag1 pada dasarna hanya mengandung seramida C18-C16, sedangken Gas1-GFP tetap lit seramida C26. Fakta enda erbahanca strain enda jadi alat si ideal guna secara khusus ndungi masalah panjang rantai asil membran seramida i bas ER. Peran hipotetis kelas ras penyortiren. Jenari, tangtangna ipelajari kami kemampuan C26 Gas1-GFP guna menumpuk i bas kelompok-kelompok i bas GhLag1 alu alel mutan sec31-1 si sensitif nandangi suhu arah mikroskopi fluoresensi konvensional, i ja rantai si gedang (C18-C16) ngenca si lit i bas membran ER Ceramide (Gbr. 3). Iperdiateken kami maka i bas sec31-1, sebagian besar Gas1-GFP terkonsentrasi i bas rumpun, sedangken Gas1-GFP i bas sec31-1 GhLag1 si gedang (C18-C16) membran ER keramida si gedang terutama la erkelompok ras tersebar i bas I bas seluruh membran ER. Tepatna, erkiteken C26 berbasis seramida clustering erhubungen erat erkiteken ERES spesifik (Gambar 1), selanjutna kami menyelidiki apakah proses enda mungkin pe melibatken fungsi mekanisme protein ekspor ER. GPI-AP make sistem COPII khusus guna ekspor ER, si aktif iaturken alu remodeling struktural Ted1′s bagin glikan jangkar GPI (30, 31). GPI-glikan rekombinan e kenca si e itandai alu kompleks p24 reseptor kargo transmembran, si i bas gilirenna secara selektif merekrut Lst1, si merupaken isoform spesifik subunit pengikat kargo COPII utama Sec24, membentuk Vesikel COPII si bayak GPI-AP-31 iperluken (31). Emaka, ibahan kami sada mutan ganda si menggabungken penghapusen protein tunggal enda (komponen kompleks p24 Emp24, enzim remodeling GPI-glikan Ted1 ras subunit COPII spesifik Lst1) ras galur mutan sec31-1, janah ipelajari kami Apakah mungkin membentuk Gasster GFP1-clu3). Iperdiateken kami maka i bas sek31-1emp24Δ ras sek31-1ted1Δ, Gas1-GFP terutama la erkelompok ras tersebar i belang-belang membran ER, bagi si enggo pernah siidah i bas sek31-1 GhLag1, sedangken i bas sek31-1lst1Δ, Gas1-GFP1 Bagi sek3. Hasil enda ncidahken maka selain litna C26 ceramide ibas membran ER, clustering Gas1-GFP pe perlu terikat ku kompleks p24, janah la perlu rekrutmen Lst1 si spesifik. Jenari, ipelajari kami kemungkinen maka gedang rantai seramida i bas membran ER banci ngaturken pengikatan Gas1-GFP ku p24. Tapi, idat kami maka litna seramida C18-C16 i bas membran labo mpengaruhi GPI-glikan si irekonstruksi kompleks p24 (Gambar S3 ras S4, A ras B) ntah pe ngiket ku GPI-AP ras mengekspor GPI-AP. beluh. Rekrut COPII subtipe Lst1 (Gambar S4C). Emaka, pengkelompoken C26 si bergantung ku seramida labo perlu interaksi protein ras mekanisme protein ekspor ER si berbeda, tapi mendukung mekanisme penyortiren alternatif si idorong gedang lipid. Jenari, ianalisa kami apakah gedang rantai asil seramida i bas membran ER penting guna klasifikasi Gas1-GFP si efektif sebage ERES selektif. Erkiteken Gas1 i bas strain GhLag1 si lit seramida rantai pendekna ndarat i bas ER nari janah masuk ku membran plasma (Gambar S5), tek kami maka adi penyortiren e igerakken alu gedang rantai asil seramida, maka Gas1 i bas strain GhLag1 banci ialihken ras ipersilahang. Barang ERES si lit selaputna si seri.
(A) Membran sel GhLag1 terutama mengandung seramida C18-C16 si lebih gendek, sedangken jangkar GPI Gas1-GFP tetap lit IPC C26 si seri ras sel tipe liar. I datas: analisis panjang rantai asil seramida i bas membran sel strain tipe liar (Wt) ras GhLag1p alu spektrometri massa (MS). Data e mewakili persentase total keramida. Rata-rata lit telu percobaan si mandiri. Kesalahen bar = SD. Dua ekor si la erpasangan t uji. **** P <0,0001. Panel i teruh : Analisis MS gedang rantai asil IPC si lit i bas jangkar GPI Gas1-GFP (GPI-IPC) si iekspresiken i bas galur tipe liar ras GhLag1p. Data e merupaken persentase sinyal IPC si lengkap. Rata-rata lima percobaan mandiri. Kesalahen bar = SD. Dua ekor si la erpasangan t uji. ns, labo penting. P = 0,9134 kalak. (B) Mikrograf fluoresensi sel-sel si mengekspresiken Gas1-GFP si iinduksi galaktosa i inkubasi i bas suhu 37°C ras Perscopy rutince selama 37°C selama 30°C. kenca 24°C. Panah si mbentar: Gugus ER Gas1-GFP. Panah terbuka: Gas1-GFP si la erkelompok tersebar i bas kerina membran ER, ncidahken pewarnaan cincin inti si khas ER. Skala batangna, 5μm. (C) Kuantifikasi fotomikrograf si ituriken ibas (B). Rata-rata persentase sel si lit strukturna Gas1-GFP si bertitik. I bas telu percobaan mandiri, n≥300 sel. Kesalahen bar = SD. Dua ekor si la erpasangan t uji. **** P <0,0001.
Guna langsung ndungi masalah enda, ilakoken kami visualisasi SCLIM Gas1-GFP ras Mid2-iRFP i bas GhLag1 alu alel mutan sec31-1 si sensitif suhu (Gambar 4 ras Film S4). Kenca ER ipertahanken i bas suhu 37°C ras selanjutna ibebasken i bas suhu 24°C, sebagian besar Gas1-GFP si mbaru isintesis la erkelompok ras tersebar ku belang-belang membran ER, bagi si iperdiateken alu mikroskop konvensional (Gambar 4, A ras B ). Selain si e, persentase ERES si mbelin (67%) termasuk dua jenis muaten si bersama-sama berlokasi i bas ia (Gambar 4D). Panel 1 ras 2 gambar 4C ncidahken dua contoh khas ERES si tumpang tindih Gas1-GFP ras Mid2-GFP. Selain si e, duana barang e i rekrut ku bas ERES si seri (Gambar 4E, panel 3 ras film S4). Emaka hasil kami ncidahken maka gedangna rantai asil seramida i bas membran ER merupaken penentu penting agregasi ras klasifikasi protein ER.
Sec31-1 Sel GhLag1 si ncidahken sekresi si ibahan galaktosa, Gas1-GFP (GPI-AP, hijau) ras Mid2-iRFP (TMP, biru) ras Sec13-mCherry si erlabel ERES konstitutif (ERES, magenta) Inkubasi i bas suhu 37°C. Terusken 30 menit, turunen ku 24°C gelah ndarat sekresi, ras gambarken alu SCLIM kenca 20 menit. (A seh ku C) Gambar proyeksi 2D si mewakili (A; batang skala, 1μm) ntah pe gambar belahan sel 3D (B ras C; satuan skala, 0,45μm) i bas 10 bagin z si itandai alu kargo ras ERES. Panel si arah teruh i bas (B) ras panel i bas (C) ncidahken gambar si enggo iproses guna ncidahken barang-barang si lit i bas ERES (magenta) saja [Gas1-GFP (abu-abu) ras Mid2-iRFP (biru terang)]. (C) Panah si iisi putih : ERES, barang tumpang tindih. Panah si terbuka: ERES lit sada barang ngenca. Panel si arah teruh : ERES si ipilih lit barang tumpang tindih (1 ras 2) si itandaina i bas (C). Skala batangna, 100 nm. (D) Kuantifikasi fotomikrograf si ituriken ibas (C). I bas unit sec31-1 ras sec31-1 GhLag1, sada ngenca muaten (Gas1-GFP ntah pe Mid2-iRFP) si imasukken, janah rata-rata persentase ERES guna muaten si terisolasi ras muaten si tumpang tindih. I bas telu percobaan mandiri, n = 432 i bas 54 sel (detik31-1) ras n = 430 i bas 47 sel (detik31-1 GhLag1). Kesalahen bar = SD. Dua ekor si la erpasangan t uji. *** P = 0,0002 (detik31-1) ras ** P = 0,0031 (detik31-1 GhLag1). (E) Gambar 3D ERES si ipilih ras muaten si tumpang tindih (3) si itandaina i bas (C). Gas1-GFP (hijau) ras Mid2-iRFP (biru) ndeheri ERES (magenta) arah sada sisi ras tetap i bas daerah si terbatas ERES si seri. Skala batangna, 100 nm.
Penelitian enda mereken bukti langsung in vivo maka kargo protein berbasis lipid iklasifikasiken ku situs ekspor selektif i bas jalur sekresi, ras ncidahken pentingna gedang rantai asil guna selektifitas klasifikasi. Alu make teknik mikroskopi si megegeh ras canggih si igelari SCLIM, icidahken kami Gas1-GFP si mbaru isintesis (membran plasma utama GPI-AP si porsi lipid seramida rantai asil (C26) si seh kal gedangna) i bas ragi ) Daerah-daerah si erkelompok i bas protein transmbrame si tersebar si tersebar arah ES si tersebar ras ES . si lit i bas membran ER (Gambar 1). Selain si e, dua jenis barang enda masuk ku ERES si berbeda secara selektif (Gambar 2). Panjang rantai asil seramida seluler ibas membran berkurang ibas C26 nari ku C18-C16, gugus Gas1-GFP terganggu ku daerah ER si terpisah, ras Gas1-GFP ialihken rute guna nadingken ER ras protein transmembran arah ERES si seri (Gambar 3 ras Gambar 3). 4).
Aminna pe GPI-AP make mekanisme protein khusus guna ndarat i bas ER nari, idat kami maka pemisahan C26 si bergantung ku seramida la mengandalken interaksi protein diferensial si banci erbahanca spesialisasi ERES (Gambar S4 ras S5). Sebalikna, temuan kami mendukung mekanisme klasifikasi alternatif si igerakken alu pengkelompoken protein berbasis lipid ras pengecualian muaten si deban selanjutna. Pengamatan kami ncidahken maka daerah ntah pe gugus Gas1-GFP si erhubungen ras ERES tertentu kurang protein Mid2-iRFP si isekresiken transmembran, si ncidahken maka gugus GPI-AP si bergantung man seramida C26 e pasti memfasilitasi masukna ku ERES si relevan, janah i bas paksa si seri, mengecualiken sekretasi transmembran tertentu enda TheGambar1). 2). Sebalikna, kehadiren seramida C18-C16 ibas membran ER labo erbahanca GPI-AP membentuk daerah ntah pe kluster, emaka labo ia mengecualiken ntah pe menggantiken protein si isekresiken transmembran ku bas ERES si seri (Gambar 3 ras 4). . Emaka, kami ngusulken gelah C26 seramida mendorong pemisahan ras klasifikasi alu memfasilitasi pengkelompoken protein si terkait ras ERES tertentu.
Uga carana gelah banci terjadi clustering C26 si bergantung man seramida enda ku bas sada daerah ER tertentu? Kecenderungan seramida membran berpisah secara lateral banci erbahanca seramida GPI-AP ras C26 membentuk lipid si kitik ras tersusun secara instan i bas lingkungen lipid si lebih la teratur i bas membran ER si mengandung gliserolipid si lebih gendek ras la jenuh. Kelompok si erkualitas (17, 18). Gugus-gugus sementara si kitik enda banci lebih menyatu jadi gugus-gugus si lebih mbelin ras stabil kenca terikat ku kompleks p24 (34). Konsisten ras si e, icidahken kami maka C26 Gas1-GFP perlu berinteraksi ras kompleks p24 guna membentuk gugus si teridah si lebih mbelin (Gambar 3). Kompleks p24 eme oligomer heterozigot si terdiri ibas empat protein transmembran p24 si berbeda ibas ragi (35), si mereken pengikatan multivalen, si banci erbahanca terjadi penghubung silang gugus GPI-AP si kitik, alu bage menghasilken gugus Stabil si lebih mbelin (34). Interaksi antara ektodomain protein GPI-AP banci ka berkontribusi ku agregasi, bagi si icidahken i bas transportasi Golgi i bas sel epitel terpolarisasi mamalia (36). Tapi, adi C18-C16 ceramide lit i bas membran ER, adi kompleks p24 terikat ku Gas1-GFP, labo kari terbentuk gugus-gugus si mbelin si terpisah. Mekanisme si mendasarisa banci saja tergantung ku sifat fisik ras kimia si khusus i bas seramida rantai asil si gedang. Studi biofisika membran buaten ncidahken maka aminna pe keramida rantai asil si gedang (C24) ras si gendek (C18-C16) banci erbahan pemisahan fase, tapi keramida rantai asil si gedang (C24) ngenca si banci mendorong Curvature si tinggi ras bending film guna membentuk mulihi film. Arah saling merujuk (17, 37, 38). Enggo teridah maka heliks transmembran TMED2, homolog manusia Emp24, secara selektif berinteraksi ras sfingomielinin berbasis seramida C18 i bas lobus sitoplasma (39). Alu make simulasi dinamika molekuler (MD), idat kami maka keramida C18 ras C26 duana menumpuk i sekelewet lobus sitoplasma heliks transmembran Emp24, janah lit preferensi si seri (Gambar S6). Perlu siteh maka enda nuduhken maka heliks transmembran Emp24 banci erbahanca terjadi persebaran lipid si asimetris ibas membran. Enda me hasil si mbaru-mbaru enda erpalasken sel-sel mamalia. Simulasi MD si seri pe ncidahken litna lipid eter (40) . Emaka, berspekulasi kami maka C26 seramida ibas dua lobus ER26 e secara lokal ipekaya. Adi GPI-AP i bas lobus luminal langsung terikat ku p24 multivalen ras akumulasi seramida C26 i sekitar p24 i bas lobus sitoplasma, maka banci mendorong agregasi Protein si menyertai ras kelengkungen membran si ihasilken arah jari-jari (41), erbahanca GPI-AP pe terpisah jadi daerah adsen si tinggi, ES si tinggi daerah-daerah si lit i bas selaput ER (42). Laporan sebelumna mendukung mekanisme si iusulken (43, 44). Ikatan multivalen oligolektin, patogen ntah pe antibodi nandangi glikosfingolipid berbasis seramida (GSL) i bas membran plasma memicu agregasi GSL si mbelin, meningkatken pemisahan fase ras menyebabken deformasi ras internalisasi membran (44). Iwabuchi rsd.
I bas sel epitel mamalia si terpolarisasi, konsentrasi jaringan anti-Golgi (TGN) ku tingkat membran plasma apikal si ngaturken pemisahan ras penyortiren GPI-AP (10, 45). Agregasi enda igerakken oligomerisasi GPI-AP (36), tapi banci ka tergantung ku gedang rantai keramida si idatken kita ibas ragi. Aminna pe GPI-AP mamalia lit jangkarna berbasis lipid eter, ras struktur kimiana tuhu-tuhu berbeda ras keramida rantai asil si tuhu-tuhu gedang, sada penelitian si mbaru-mbaru enda ncidahken maka kedua lipid e secara evolusioner lit sifat fisik ras kimia si mirip Ras fungsina (40). Emaka bagin lipid eter ibas sel mamalia banci saja mirip ras seramida C26 ibas ragi, janah peranna eme berhubungan ras seramida berantai panjang ibas membran guna mendorong agregasi ras penyortiren GPI-AP. Aminna pe kemungkinan enda perlu denga iuji secara langsung, temuan sebelumna mendukung maka transportasi seramida rantai asil si gedang ku badan Golgi labo ilakoken protein transfer sitoplasma, tapi tergantung ku sintesis jangkar GPI bagi ragi. Emaka mekanisme konservatif evolusioner tempa-tempa banci secara selektif bersama-sama ngangkut keramida rantai asil si seh kal gedangna ras GPI-AP (13, 16, 20, 46, 47) i bas vesikel pengangkuten si seri.
I bas sistem sel epitel si terpolarisasi ragi ras mamalia, agregasi GPI-AP ras pemisahan i bas protein membran plasma si deban nari kerina terjadi ope denga seh ku permukaan sel. Paladino ras teman-temanna. (48) idatna maka i bas TGN sel epitel mamalia si terpolarisasi, pengkelompoken GPI-AP labo saja iperluken guna klasifikasi selektif GPI-AP ku membran plasma apikal, tapi pe ngaturken pengkelompoken GPI-AP ras aktivitas biologisna. Permukaan sel si lit. I bas ragi, penelitian enda ncidahken maka gugus GPI-AP si bergantung ku seramida C26 i bas ER banci ngaturken organisasi gugus ras aktivitas fungsional GPI-AP i bas membran plasma (24, 49). Konsisten ras model enda, sel GhLag1 alergi nandangi penghambat GPI ntah pe obat-obatan si mpengaruhi integritas dinding sel (28), ras kebutuhen kluster Gas1-GFP fungsional (49) keramida ujung si iproyeksiken i bas perkawinen sel ragi ncidahken G Kemungkinan konsekuensi fisiologis sel hLag1. Kesalahen GPI-AP. Tapi, pengujian selanjutna apakah organisasi fungsional permukaan sel enggo iprogramken i bas ER nari alu metode penyortiren erpalasken gedang lipid si jadi bahan penelitianta ku lebe.
Galur Saccharomyces cerevisiae si ipake ibas karya enda isuratken ibas Tabel S1. Strain MMY1583 ras MMY1635 SCLIM guna pencitraan sel nggeluh ibangun alu latar belakang W303. Strain enda si mengekspresiken Sec13-mCherry alu tag protein neon ibahan alu make metode berbasis reaksi berantai polimerase (PCR) alu plasmid pFA6a jadi cetakan (23). Galur si mengekspresiken Mid2-iRFP si ilabeli alu protein fluoresen i teruh kendali promotor GAL1 ibangun bagi si tersena i teruh enda. Amplifikasi PCR uruten iRFP-KanMx i bas vektor pKTiRFP-KAN nari (hadiah E. O’Shea, nomor plasmid addgene 64687; Kenca uruten genom Mid2-iRFP iperkuat ras ikloning ku promotor GAL1, maka i terintegrasi ku situs Not I-Sac I plasmid integrasi pRS306. Plasmid pRGS7 si ihasilken i linierisasi ras Pst I guna terintegrasi ku lokus URA3.
Gen fusi Gas1-GFP iekspresiken i teruh kendali promotor GAL1 ibas plasmid centromer (CEN), si ibangun bagi si tersena i teruh enda. Uruten Gas1-GFP ipegegehi alu PCR i bas plasmid pRS416-GFP (24) (hadiah L. Popolo) nari ras ikloning ku situs Xma I-Xho I plasmid CEN pBEVY-GL LEU2 (hadiah C) . Tukang; Plasmid tambahen si nomor 51225; 51225: 51225; RRID: Tambahan_51225). Plasmid si ihasilken e ibahan gelarna pRGS6. Gen fusi Axl2-GFP pe iekspresiken i teruh kendali promotor GAL1 vektor pBEVY-GL LEU2, janah konstruksina bagi si tersena i teruh enda. Uruten Axl2-GFP iperkuat arah plasmid pRS304-p2HSE-Axl2-GFP (23) alu PCR, janah ikloning ku situs Bam HI-Pst I vektor LEU2 pBEVY-GL. Plasmid si ihasilken e ibahan gelarna pRGS12. Uruten oligonukleotida si ipake ibas penelitian enda isuratken ibas Tabel S2.
Galur e itambahi alu 0,2% adenin ras 2% glukosa [YP-dekstrosa (YPD)], 2% rafinosa [YP-rafinosa] bayak ekstrak ragi protein p (YP) media (1 % ekstrak ragi ras 2% protein ept). (YPR)] ntah pe 2% galaktosa [YP-galaktosa (YPG)] jadi sumber karbon, ntah pe i bas media minimal sintetis (0,15% basa nitrogen ragi ras 0,5% amonium sulfat) guna nambahi asam amino ras basa si tepat si iperluken guna nutrisi , Janah mengandung 2% media galaktosa minimal2 ntah pe glukosa (media minim galaktosa sintetis) sebage sumber karbon.
Guna pencitraan waktu nyata, sel mutan sec31-1 si sensitif nandangi suhu si mengekspresiken konstruksi i teruh promotor GAL1 ipertumbuhken i bas media YPR i bas suhu 24°C semalamen seh ku fase tengah log. Kenca induksi i bas YPG i bas suhu 24°C selama 1 jam, sel-sel e iinkubasi i bas SG i bas suhu 37°C selama 30 menit, kenca si e ipindahken ku 24°C guna ibebasken i bas blok sekresi nari. Concanavalin A ipake guna mpehuli sel-sel e i bas slide kaca janah icitraken alu SCLIM. SCLIM eme kombinasi mikroskop fluoresensi terbalik Olympus IX-71 ras lensa minak bukaan numerik UPlanSApo 100 × 1,4 (Olympus), sistem pemindai konfokal cakram si erputar ras rasio sinyal-ku-suara si tinggi, spektrometer konfokal imaji khusus (Yokogawa Electric ras khusus), (Fotonik Hamamatsu) banci mereken sistem lensa pembesar alu perbesaran akhir ×266,7 ras kamera alat si igabungken muaten si mpebelang elektron (Fotonik Hamamatsu) (21). Pengambilan gambar ilakoken alu perangkat lunak khusus (Yokogawa Listrik). Bagi gambar 3D, ipake kami aktuator piezoelektrik si ibahan khusus guna nggetarken lensa objektif secara vertikal, janah ipepulung kami bagin-bagin optik si jarakna 100 nm i bas sada tumpuken. Gambar Z-stack iubah jadi data voxel 3D, janah fungsi penyebaran titik teoritis si ipake guna mikroskop konfokal cakram si erputar ipake guna pengolahen dekonvolusi alu perangkat lunak Volocity (PerkinElmer). Alu make software Volocity guna otomatis ambang batas guna analisis ko-lokasi, ERES termasuk kargo iukur. Analisis line scan ilakoken alu make perangkat lunak MetaMorph (Perangkat Molekuler).
Gunakenlah perangkat lunak GraphPad Prism guna nentuken signifikansi statistik. Bagi uji t Student dua ekor ras uji analisis varians searah (ANOVA) biasa, perbedan antar kelompok ianggap berdampak signifikan nandangi P <0,05 (*).
Bagi mikroskopi fluoresensi Gas1-GFP, sel-sel fase log ipertumbuhken semalam i YPD ras ipepulung alu sentrifugasi, icuci dua kali alu saline penyangga fosfat, ras iinkubasi i datas es minimal 15 menit, kenca si e ilanjutken i teruh mikroskop bagi si enggo ituriken sebelumna (Check24). Mikroskop Leica DMi8 (HCX PL APO 1003/1,40 minyak PH3 CS) si ilengkapi alu lensa objektif, filter L5 (GFP), kamera Hamamatsu ras perangkat lunak Application Suite X (LAS X) ipake guna akuisisi. .
Sampel-sampel e i denaturasi alu penyangga sampel SDS ibas suhu 65°C selama 10 menit, kenca si e ipisahken alu elektroforesis gel SDS-poliakrilamida (PAGE). Guna analisis imunoblotting, 10 μl sampel i muat per jalur. Antibodi primer : Gunaken anti-Gas1 poliklonal kelinci alu pengenceren 1:3000, anti-Emp24 poliklonal kelinci alu pengenceren 1:500, ras anti-GFP poliklonal kelinci (hadiah H. Riezman) alu pengenceren 1:3000. Antibodi anti-Pgk1 monoklonal tikus ipake alu pengenceren 1:5000 (hadiah i bas J. de la Cruz nari). Antibodi sekunder : Imunoglobulin G (IgG) anti kelinci kambing si ikonjugasi peroksidase lobak (HRP) si ipake alu pengenceren 1:3000 (Pierce). IgG anti tikus kambing si ikonjugasi HRP ipake alu pengenceren 1:3000 (Pierce). Zona respon imun iperdiateken alu metode kemiluminesens reagen Pico Barat SuperSignal (Thermo Fisher Ilmiah).
Bagi si enggo ituriken i bas (31), percobaan imunopresipitasi alami ilakoken nandangi fraksi ER si enggo ipekaya. Singkatna, cuci sel ragi alu penyangga TNE [tris-HCl 50 mM (pH 7,5), NaCl 150 mM, EDTA 5 mM, campuren fenilmetilsulfonil fluorida ras penghambat protease 1 mM) i bas suhu 600 nm ( OD600 dua kali) i bas 100 optik. Ipecah alu manik-manik kaca, kenca si e ibuat puing-puing sel ras manik-manik kaca alu cara sentrifugasi. Supernatan e kenca bage isentrifugasi alu 17.000 g selama 15 menit alu suhu 4°C. Pelet e isuspensi mulihi ibas TNE ras saponin digitalis itambahken seh ku konsentrasi akhir 1%. Suspensi e i inkubasi 1 jam alu rotasi ibas suhu 4°C, kenca si e komponen-komponen si la terlarut ibuat alu sentrifugasi 13.000 g ibas suhu 4°C selama 60 menit. Guna imunopresipitasi Gas1-GFP, tangtangna pra-inkubasi sampel alu manik-manik agarose kosong (ChromoTek) i bas suhu 4°C selama 1 jam, kenca si e inkubasi alu GFP-Trap_A (ChromoTek) i bas suhu 4°C selama 3 jam. Manik-manik si imunopresipitasi e icuci lima kali alu TNE si mengandung digoksigenin 0,2%, ielusi alu penyangga sampel SDS, ipisahken i bas SDS-PAGE, janah ianalisis alu imunoblotting.
Bagi si enggo ituriken i bas (31), penentuan cross-linking ilakoken i bas fraksi ER si ipekaya. Singkatna, fraksi ER si enggo ipekaya e iinkubasi alu ditiobis (suksinimidil propionat) 0,5 mM (Pierce, Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, AS; 20°C, 20 min). Reaksi pengikat silang e ipadamken alu nambahi glisin (konsentrasi akhir 50 mM, 5 menit, 20°C).
Bagi si enggo ituriken ndai (50), ilakoken analisis MS seramida i bas strain tipe liar ras GhLag1. Singkatna, sel-sel ipertumbuhken ku fase eksponensial (3 seh ku 4 unit OD600/ml) i bas YPD i bas suhu 30°C, janah 25×107 sel ipanen. Metabolisme kalak enda ipadamken alu asam triklorasetat. Gunaken pelarut ekstraksi [etanol, lau, eter, piridin ras amonium hidroksida 4,2 N (15:15:5:1:0,018 v/v)] ras 1,2 nmol standar internal seramida C17 (860517, lipid kutub Avanti) si berkualitas). Gunaken reagen monometilamin [metanol, lau, n-butanol ras larutan metilamin (4:3:1:5 v/v)] guna ngelakoken hidrolisis basa ringan ekstrak e, kenca si e gunaken n-butanol si jenuh lau guna mbuang garam. Kedungenna, ekstrak e isuspensi mulihi ku bas pelarut mode positif [kloroform/metanol/lau (2:7:1) + amonium asetat 5 mM] janah isuntikken ku bas spektrometer massa. Pemantauan multi reaksi (MRM) ilakoken guna identifikasi ras kuantifikasi molekul sfingolipid. Spektrometer massa quadrupole tersier TSQ Vantage (Thermo Fisher Scientific) ilengkapi alu sumber ion aliren nano robot Nanomate HD (Advion Biosciences, Ithaca, NY) guna analisis lipid. Energi tabraken e ioptimalken guna tiap kategori keramida. Data MS idatken alu mode positif. Bagi tiap replika biologis, sinyal lipid eme median ibas telu pengukuren mandiri.
Bagi si ituriken i bas (31), sel-sel (800×107) si mengekspresiken Gas1-GFP ibahan imunopresipitasi alami. Gas1-GFP si enggo imurniken e ipisahken alu SDS-PAGE janah ipindahken ku membran poliviniliden fluorida (PVDF). Protein e ivisualken alu mewarnai PVDF alu amida hitam. Pita Gas1-GFP igunting ibas PVDF nari janah icuci 5 kali alu metanol ras sekali alu lau kelas kromatografi cair-MS (LC-MS). Alu inkubasi strip membran alu 500 μl NaOAc 0,3 M (pH 4,0), penyangga ras 500 μl campuran natrium nitrit 1 M si mbaru ilarutken i bas suhu 37°C selama 3 jam, fraksi lipid i lepasken i bas Gas1-GFP ras inosamin folis antara Pelepasen inosamin . (51). Kenca si e, strip membran e icuci empat kali alu lau kelas LC-MS, ikeriken i bas suhu kamar, janah isimpan i bas atmosfer nitrogen si suhu -80°C seh i analisis. Sebage kontrol, ipake sampel kosong membran PVDF guna tiap percobaan. Lipid si i ekstraksi ibas Gas1-GFP nari kenca si e i analisis alu MS bagi si enggo ituriken (50). Singkatna, strip PVDF si lit GPI-lipidna isuspensi mulihi i bas pelarut cetakan negatif 75μl [kloroform/metanol (1:2) + amonium asetat 5 mM] ras lulus ionisasi elektrosemprot (ESI)-Analisis MRM/MS spesies sfingolipid (TSQ Vantage). Ibas hal enda, data MS idatken ibas mode ion negatif.
Bagi si enggo ituriken ndai, bagin lipid jangkar GPI ipisahken i bas GPI-AP si lit labelna [3H]-inositol nari (16). Lipid-lipid e ipisahken alu kromatografi lapisen tipis alu make sistem pelarut (55:45:10 kloroform-metanol-0,25% KCl) ras ivisualken alu make FLA-7000 (Fujifilm).
Sel-sel si mengekspresiken Gas1-GFP (600×107) icuci dua kali alu penyangga TNE alu penyangga TNE, janah ipecah alu manik-manik kaca, kenca si e isentrifugasi guna mbuang puing-puing sel ras manik-manik kaca. Supernatan e kenca si e i sentrifugasi alu 17.000 g selama 1 jam i bas suhu 4°C. Pelet e icuci ibas TNE ras iinkubasi alu 1 U PI-PLC (Invitrogen) ibas TNE si mengandung saponin digitalis 0,2% selama 1 jam ibas suhu 37°C. Kenca enggo ibahan perlakuan enzim, membran e ibuat alu sentrifugasi 17.000 g i bas suhu 4°C selama 1 jam. Guna imunopresipitasi Gas1-GFP, supernatan e iinkubasi alu GFP-Trap_A (ChromoTek) i bas suhu 4°C sedekah sada berngi. Gas1-GFP si enggo imurniken si ipisahken alu SDS-PAGE iwarnai alu warna biru cemerlang Coomassie. Pita pewarnaan Gas1-GFP ipotong i bas warna abu-abu si lit i sekelewet akuaduk nari, kenca si e kenca alkilasi alu iodoasetamida ras reduksi alu ditiotreitol, ilakoken pencernaan in-gel alu tripsin. Ekstrak ras keringken peptida triptik ras peptida alu GPI-glikan. Peptida si enggo kering e ilarutken ibas 20 μl lau. Suntikken sada bagin (8μl) ku bas LC. 150 mm×1,0 mm; Nomura Kimia, Prefektur Aichi, Jepang) ipake guna misahken peptida i bas kondisi gradien tertentu. Fase si bergerak eme pelarut A (0,08% asam formik) ras pelarut B (0,15% asam formik ibas 80% asetonitril). Sistem HPLC Accela (Thermo Fisher Scientific, Boston, Massachusetts) ipake guna ngeluasi kolom alu pelarut A i bas waktu 55 menit alu laju aliren 50 μl min-1 selama 5 menit, kenca si e konsentrasi pelarut B itambahken jadi 40%. , Amerika Serikat). Eluat e terus imasukken ku sumber ion ESI, janah peptida triptik ras peptida si lit GPI-glikanna ianalisis alu LTQ Orbitrap XL (spektrometer massa perangkap-orbitrap ion linier hibrida; Thermo Fisher Ilmiah). Ibas pengaturen MS, tegangan sumber kapiler ibahan 4,5 kV, janah suhu kapiler transfer ijaga 300°C. Tegangan kapiler ras tegangan lensa tabung ibahan jadi 15 V ras 50 V. Data MS idatken alu mode ion positif (resolusi 60.000; akurasi massa 10 bagin per juta) i bas rentang massa 300/m/z rasio massa/muatan (m/z) 3000. Data MS/MS tergantung arah perangkap ion i bas XLthe dibit si pemena [Ors3]. disosiasi si ibahan tabraken (CID)].
Simulasi MD ilakoken alu make perangkat lunak GROMACS (52) ras medan gaya MARTINI 2 (53-55). Pembangun Membran GUI CHARMM (56, 57) kenca si e ipake guna membangun lapisen ganda si mengandung dioleoilfosfatidilkolin (DOPC) ras Cer C18 ntah pe DOPC ras Cer C26. Topologi ras koordinat Cer C26 ibuat ibas DXCE nari alu mbuang manik-manik ekstra ibas ikur sfingosin nari. Gunaken proses si ituriken i teruh enda guna menyeimbangken lapisen ganda ras ndalankenca, kenca si e gunaken koordinat terakhir sistem guna membangun sistem si mengandung Emp24. Domain transmembran ragi Emp24 (residu 173 seh ku 193) ibahan jadi α-heliks alu make struktur molekul alat MD (VMD) visual (58). Jenari, kenca itangtangi lipid si tumpang tindih, protein e i granulasi alu kasar janah imasukken ku lapisen ganda alu make CHARMM GUI. Sistem si terakhir lit 1202 DOPC ras 302 Cer C26 ntah pe 1197 DOPC ras 295 Cer C18 ras Emp24. Ionken sistem e seh ku konsentrasi 0,150M. Empat replika mandiri ibahan guna dua komposisi lapis ganda.
Lapisen ganda lipid e iimbangi alu make proses CHARMM GUI, si ngelibatken meminimalken ras kenca si e menyeimbangken 405.000 langkah, i ja kendala posisi secara bertahap i kurangi ras ihilangkan, ras langkah waktu itambahken i bas 0,005 ps nari jadi 0,02 ps. Kenca enggo seimbang, maka ihasilkenna 6 μs alu langkah waktu 0,02 ps. Kenca enggo imasukken Emp24, pake proses GUI CHARMM si seri guna meminimalken ras menyeimbangken sistem, jenari erdalan 8 s ibas produksi.
Bagi kerina sistem, ibas proses penyeimbangen, tekanan ikuasai barostat Berendsen (59), janah ibas proses produksi, tekanan ikuasai barostat Parrinello-Rahman (60). I bas kerina kasus, tekanan rata-rata 1 bar ras skema kopling tekanan semi-isotropik ipakena. Ibas proses keseimbangan ras produksi, termostat (61) alu rekalibrasi kecepatan ipake guna menyatuken suhu partikel protein, lipid ras pelarut masing-masing. Ibas kerina operasi, suhu si itargetkan eme 310K. Interaksi non-ikatan e ihitung alu menghasilken daftar pasangan alu make skema Verlet alu toleransi penyangga 0,005. Istilah Coulomb ihitung alu make medan reaksi ras jarak potong 1,1 nm. Istilah Vander Waals make skema potong alu jarak potong 1,1 nm, janah skema potong Verlet ipake guna potensi penyimpangan (62).
Alu make VMD, panjang gelombang cutoff antara manik-manik fosfat DOPC ntah pe manik-manik seramida AM1 ras protein eme 0,7 nm, janah jumlah lipid si berinteraksi ras protein e iperhitungken. Rikutken rumus berikut, hitunglah faktor penghapusan-pengayaan (DE) bagi ibas (63): Faktor DE = (jumlah total lipid ibas protein 0,7) ibas protein 0,7 (jumlah Cer ibas total lipid) .
Nilai si ilaporken idatken sebage rata-rata, janah bar kesalahan eme empat salinen independen SE. Signifikansi statistik faktor DE ihitung alu uji t [(rata-rataDE-faktor-1)/SE]. Hitunglah nilai P ibas distribusi si sada ekor nari.
Alat GROMACS ipake guna menghitung peta kepadaten lateral 2D sistem si mengandung Emp24 ibas 250 ns terakhir jejak. Guna ndatken peta pengayaan/penghabisan seramida, peta kepadaten Cer ibagi alu jumlah peta Cer ras DOPC, kenca si e ibagi alu konsentrasi Cer ibas kula. Skala peta warna si seri ipakena.
Guna bahan tambahen guna artikel enda, banci idahndu i bas http://advances.sciencemag.org/cgi/isi/lengkap/6/50/eaba8237/DC1.
Enda me sada artikel akses terbuka si ibagiken alu ketentuan Lisensi Atribusi-Non-Komersial Creative Commons, si banci ipake, ibagiken ras ireproduksi i bas media kai pe, asalken penggunaan akhir labo guna keuntungen komersial ras premisna eme maka karya aslina benar. Referensi.
Cataten: Kami hanya mindo gelah iberekenndu alamat emailndu gelah kalak si irekomendasikenndu ku halaman e meteh maka atendu idahna email e janah labo spam. Labo itangkap kami alamat email si lit.
Penungkunen enda ipake guna nguji kam pengunjung ntah lang ras mencegah pengirimen spam otomatis.
· Gomez (Alejandro Cortes-Gomez), Atsuko Ikeda (Atsuko Ikeda), Valeria Zoni (Valeria Zoni), Auxiliadora Aguilera-Romero, Ana Maria Perez Logihope -Linero), Waga, Misako Arman (Misako Arman), Miyako Riman (Miyako Riman), Prow Akira, Stefano Fanny, Akihiko Nakano, Manuel Muniz
Pencitraan real-time 3D resolusi tinggi ncidahken pentingna gedang rantai seramida guna penyortiren protein i bas situs keluaren si selektif.
· Gomez (Alejandro Cortes-Gomez), Atsuko Ikeda (Atsuko Ikeda), Valeria Zoni (Valeria Zoni), Auxiliadora Aguilera-Romero, Ana Maria Perez Logihope -Linero), Waga, Misako Arman (Misako Arman), Miyako Riman (Miyako Riman), Prow Akira, Stefano Fanny, Akihiko Nakano, Manuel Muniz
Pencitraan real-time 3D resolusi tinggi ncidahken pentingna gedang rantai seramida guna penyortiren protein i bas situs keluaren si selektif.
©2020 Asosiasi Amerika guna Kemajun Ilmu Pengetahuan. kerina hak cipta lit i bas ia. AAAS eme mitra HINARI, AGORA, OARE, KOOR, JAMSS, Ref Silang ras PENGHITUNG. Kemajun Ilmu Pengetahuan ISSN 2375-2548.