Metabolit imunomodulator eme fitur kunci lingkungen mikro tumor (TME), tapi alu piga-piga pengecualian, identitasna tetap sebagian besar la ieteh. I jenda, kami nganalisis tumor ras sel T i bas tumor ras asma pasien karsinoma serous bertingkat tinggi (HGSC) guna mpebetehken metabolom kompartemen TME si berbeda enda. Asma ras sel tumor lit perbedan metabolit si mbelin. Adi ibandingken ras asma, sel T si infiltrasi tumor secara signifikan ipekaya alu 1-metilnikotinamida (MNA). Aminna pe tingkat MNA i bas sel T meningkat, ekspresi nikotinamida N-metiltransferase (enzim si mengkatalisis pemindahen gugus metil i bas S-adenosilmetionin nari ku nikotinamida) terbatas i bas fibroblas ras sel tumor. Secara fungsional, MNA menginduksi sel T guna merembesken sitokin si mendorong tumor faktor nekrosis tumor alfa. Emaka, MNA si berasal i bas TME nari berkontribusi i bas pengaturen kekebalen sel T ras mewakili target imunoterapi si berpotensi guna pengobatan kanker manusia.
Metabolit si berasal ibas tumor nari banci mereken efek penghambat si mbages nandangi kekebalen anti tumor, janah reh buena bukti si ncidahken maka ia pe banci jadi pendorong kunci guna perkembangen pinakit (1). Selain efek Warburg, pendahin si mbaru-mbaru enda enggo mulai nciriken keadaan metabolisme sel tumor ras hubungenna ras keadaan kekebalen lingkungen mikro tumor (TME). Penelitian kerna model tikus ras sel T manusia enggo ncidahken maka metabolisme glutamin (2), metabolisme oksidatif (3) ras metabolisme glukosa (4) banci bertindak secara mandiri nandangi erbage subkelompok sel kekebalen. Piga-piga metabolit ibas jalur enda menghambat fungsi anti tumor sel T. Enggo terbukti maka blokade koenzim tetrahidrobiopterin (BH4) banci ncedai proliferasi sel T, janah peningkatan BH4 ibas kula banci meningkatken respon imun anti tumor si imediasi CD4 ras CD8. Selain si e, efek imunosupresif kynurenin banci iselamatken alu pemberian BH4 (5). I bas glioblastoma mutan isositrat dehidrogenase (IDH), sekresi enantiometabolik (R)-2-hidroksiglutarat (R-2-HG) menghambat aktivasi sel T, proliferasi ras Aktivitas sitolisis (6). Baru-baru enda, enggo teridah maka metilglioksal, produk sampingen glikolisis, ihasilken sel-sel supresor asal mieloid, ras transfer sel T metilglioksal banci menghambat fungsi sel T efektor. I bas perawaten, netralisasi metilglioksal banci ngatasi aktivitas sel penekan berasal mieloid (MDSC) ras secara sinergis meningkatken terapi blokade pos pemeriksaan i bas model tikus (7). Studi-studi enda secara kolektif menekanken peran kunci metabolit si berasal ibas TME ibas ngaturken fungsi ras aktivitas sel T.
Disfungsi sel T enggo melala ilaporken ibas kanker ovarium (8). Hal enda sebagin erkiteken karakteristik metabolisme si lit ibas hipoksia ras pembuluh darah tumor si la normal (9), si erbahanca terjadi konversi glukosa ras triptofan jadi produk sampingen bagi asam laktat ras kynurenin. Laktat ekstraseluler si berlebihen mengurangi produksi interferon-γ (IFN-γ) ras mendorong diferensiasi subkelompok mielosupresif (10, 11). Konsumsi triptofan secara langsung menghambat proliferasi sel T ras menghambat pensinyalan reseptor sel T (12-14). Aminna pe pengamatan enda, melala dahin seputar metabolisme imun ilakoken i bas kultur sel T in vitro alu make media si ioptimalken, ntah pe terbatas ku model tikus homolog in vivo, si sada pe la sepenuhna ncidahken heterogenitas kanker manusia ras lingkungen makro ras mikro Fisiologis.
Sada ciri umum kanker ovarium eme penyebaran peritoneum ras munculna asma. Penumpuken cairan sel ibas asma berhubungen ras pinakit si enggo lanjut ras prognosis si la mehuli (15). Menurut laporen, kompartemen si unik enda hipoksik, lit kadar faktor pertumbuhen endotel pembuluh darah (VEGF) ras indoleamin 2,3-dioksigenase (IDO) si tinggi, janah i infiltrasi sel pengatur T ras sel penghambat mieloid (15-18). Lingkungen metabolisme asma banci berbeda ras tumor e sendiri, emaka pemrograman ulang sel T i bas ruang peritoneum la jelas. Selain si e, perbedan kunci ras heterogenitas antara asma ras metabolit si lit i bas lingkungen tumor banci menghambat infiltrasi sel kekebalen ras fungsina nandangi tumor, janah perlu penelitian lebih lanjut.
Guna ndungi masalah enda, irancang kami sada metode pemisahan sel sensitif ras spektrometri massa tandem kromatografi cair (LC-MS/MS) guna mpelajari jenis sel si berbeda (termasuk sel CD4 + ras CD8 + T) bage pe i bas ras antar tumor Metabolitna ngelilingi sel-sel i bas asma si seri ras lingkungen pasien tumor. Kami make metode enda i bas hubungenna ras sitometri aliren dimensi tinggi ras uruten RNA sel tunggal (scRNA-seq) guna mereken potret si terselesaikan tinggi kerna status metabolisme populasi kunci enda. Metode enda ncidahken peningkatan si signifikan ibas kadar 1-metilnikotinamida (MNA) ibas sel T tumor, ras percobaan in vitro ncidahken maka efek imunomodulator MNA nandangi fungsi sel T sebelumna la ieteh. Secara umum, metode enda ncidahken interaksi metabolisme si saling antara tumor ras sel kekebalen, ras mereken wawasen si unik kerna metabolit pengaturen kekebalen, si banci erguna guna pengobatan imunoterapi kanker ovarium berbasis sel T Peluang pengobatan.
Igunaken kami sitometri aliren dimensi tinggi guna ngukurken pengambilan glukosa secara serentak. penanda khas si mbedaken sel imun ras populasi sel tumor (Tabel S2 ras Gambar S1A). Analisis enda ncidahken maka adi ibandingken ras sel T, sel asma ras tumor lit tingkat pengambilan glukosa si lebih tinggi, tapi lit perbedan aktivitas mitokondria si lebih kitik. Rata-rata pengambilan glukosa sel tumor [CD45-EpCAM (EpCAM)+] eme telu seh empat kali lipat asangken sel T, ras rata-rata pengambilan glukosa sel CD4 + T eme 1,2 kali lipat asangken sel CD8 + T, si nuduhken Limfosit si infiltrasi tumor i bas limfosit si infiltrasi Tumor i bas persyaraten TME si berbeda siGambar e). Sebalikna, aktivitas mitokondria ibas sel tumor mirip ras sel CD4 + T, janah aktivitas mitokondria ibas dua jenis sel e lebih tinggi asangken sel CD8 + T (Gambar 1B). Secara umum, hasil enda ncidahken tingkat metabolisme. Aktivitas metabolisme sel tumor lebih tinggi asangken sel CD4 + T, janah aktivitas metabolisme sel CD4 + T lebih tinggi asangken sel CD8 + T. Aminna pe efek enda lintas jenis sel, la lit perbedan si konsisten ibas status metabolisme sel T CD4 + ras CD8 + ntah pe proporsi relatifna ibas asma adi ibandingken ras tumor (Gambar 1C). Sebalikna ibas fraksi sel CD45, proporsi sel EpCAM+ ibas tumor meningkat adi ibandingken ras asma (Gambar 1D). Iperdiateken kami ka perbedan metabolisme si jelas antara komponen sel EpCAM+ ras EpCAM-. Sel EpCAM+ (tumor) lebih tinggi pengambilan glukosa ras aktivitas mitokondria asangken sel EpCAM-, si ndauh lebih tinggi asangken aktivitas metabolisme fibroblas ibas sel tumor ibas TME (Gambar 1, E ras F).
(A ras B) Intensitas fluoresensi median (LKM) pengambilan glukosa (2-NBDG) (A) ras aktivitas mitokondria sel CD4 + T (MitoTracker merah gelap) (B) Grafik perwakilen (kiri) ras data si itabulasiken (Kanan), sel CD8 + T ras sel tumor EpCAM + CD45-. (C) Rasio sel CD4 + ras CD8 + (sel CD3 + T) ibas asma ras tumor. (D) Proporsi EpCAM + sel tumor i bas asma ras tumor (CD45−). (E ras F) EpCAM + CD45-tumor ras EpCAM-CD45-matriks pengambilan glukosa (2-NBDG) (E) ras aktivitas mitokondria (MitoTracker merah gelap) (F) grafik perwakilen (kiri) ras data si itabulasiken ( Kanan) Asma ras sel tumor. (G) Grafik perwakilen ekspresi CD25, CD137 ras PD1 alu sitometri aliren. (H ras I) Ekspresi CD25, CD137 ras PD1 i bas sel T CD4 + (H) ras sel T CD8 + (I). (J ras K) Fenotipe naif, memori pusat (Tcm), efektor (Teff) ras memori efektor (Tem) erpalasken ekspresi CCR7 ras CD45RO. Gambar perwakilen (kiri) ras data tabular (kanan) sel CD4 + T (J) ras sel CD8 + T (K) i bas asma ras tumor. Nilai P itentuken alu uji t si erpasangen (*P<0,05, **P<0,01 ras ***P<0,001). Garis e mewakili pasien si cocok (n = 6). FMO, pendar si kurang sada; LKM, intensitas pendar si rata-rata.
Analisis selanjutna ncidahken perbedan signifikan si deban antara status fenotipik sel T si sangat terselesaikan. Memori si iaktifken (Gambar 1, G seh I) ras efektor (Gambar 1, J ras K) i bas tumor ndauh lebih rusur asangken asma (proporsi sel CD3 + T). Bagepe, menganalisis fenotipe alu ekspresi penanda aktivasi (CD25 ras CD137) ras penanda kehabisan [protein kematen sel terprogram 1 (PD1)] ncidahken maka aminna pe karakteristik metabolisme populasi enda berbeda (Gambar S1, B seh ku E) , Tapi la lit perbedan metabolisme si signifikan si iperhatiken ntah pe secara konsisten (Gambar S1). F ku I). Hasil enda ikonfirmasi alu make metode pembelajaran mesin guna secara otomatis menetapken fenotipe sel (21), si selanjutna ncidahken litna sel sumsum tulang si melala (CD45 + / CD3- / CD4 + / CD45RO +) i bas asma pasien (Gambar S2A ). I bas kerina jenis sel si enggo iidentifikasi, populasi sel mieloid enda ncidahken pengambilan glukosa ras aktivitas mitokondria si meganjangna (Gambar S2, B seh ku G). Hasil enda ncidahken perbedan metabolisme si megegeh antara piga-piga jenis sel si lit i bas asma ras tumor i bas pasien HGSC.
Tantangan utama ibas memahami karakteristik metabonomi TIL eme perluna mengisolasi sampel sel T si cukup murni, kualitas ras kuantitasna ibas tumor nari. Studi-studi si mbaru-mbaru enda ncidahken maka cara penyortiren ras pengayaan manik-manik erpalasken aliren sitometri banci erbahan perubahen profil metabolit seluler (22-24). Guna ngatasi masalah enda, kami mengoptimalken metode pengayaan manik guna mengisolasi ras mengisolasi TIL ibas kanker ovarium manusia si ireseksi secara bedah ope denga ianalisis alu LC-MS/MS (nen Bahan ras Cara; Gambar 2A). Guna menilai dampak keseluruhen protokol enda nandangi perubahen metabolit, ibandingken kami profil metabolit sel T si iaktifken donor si sehat kenca langkah pemisahan manik i datas ras sel si la manik-manik si ipisahken tapi tetap i datas es. Analisis kontrol kualitas enda ncidahken maka lit korelasi si tinggi antara dua kondisi enda (r = 0,77), ras keterbaliken teknis kelompok 86 metabolit lit keterbalikenna si tinggi (Gambar 2B). Emaka, metode-metode enda banci ngelakoken analisis metabolit si akurat i bas sel-sel si mengalami pengayaan jenis sel, alu bage mereken platform resolusi tinggi si pemena guna ngidentifikasi metabolit-metabolit tertentu i bas HGSC, alu bage banci kalak ndatken pemahamen si lebih mbages kerna spesifisitas sel Program metabolisme seksual.
(A) Diagram skematik pengayaan manik magnet. Sope i analisis alu LC-MS/MS, sel-sel e bakal mengalami pengayaan manik magnet telu putaren berturut-turut ntah pe tetap i datas es. (B) Pengaruh jenis pengayaan nandangi kelimpahen metabolit. Rata-rata telu ukuren guna tep-tep jenis pengayaan ± SE. Garis abu-abu e merupaken hubungen 1:1. Korelasi intra-kelas (ICC) pengukuren si iulang-ulang si icidahken i bas label sumbu. NAD, eme nikotinamida adenin dinukleotida. (C) Diagram skematis alur kerja analisis metabolit pasien. Asma ntah pe tumor ipepulung i bas pasien nari janah iawetken i bas krio. Bagin si kitik ibas tep-tep sampel ianalisis alu flow cytometry, sedangken sampel si tading ilakoken telu putaren pengayaan guna sel CD4+, CD8+ ras CD45-. Pecahen sel enda ianalisis alu make LC-MS/MS. (D) Peta panas kerna kelimpahen metabolit si enggo ibakuken. Dendrogram e mewakili pengkelompoken Ward kerna jarak Euclidean antar sampel. (E) Analisis komponen utama (PCA) peta metabolit sampel, ncidahken telu replika tiap sampel, sampel ibas pasien si seri ihubungken alu sada garis. (F) PCA profil metabolit sampel si ikondisiken man pasien (ertina, make redundansi parsial); jenis sampel si ibatasi alu lambung cembung. PC1, komponen utama 1; PC2, komponen utama si peduaken.
Selanjutna, iterapken kami metode pengayaan enda guna nganalisis 99 metabolit i bas fraksi sel CD4 +, CD8 + ras CD45 i bas asma ras tumor primer i bas enem pasien HGSC (Gambar 2C, Gambar S3A ras Tabel S3 ras S4). Populasi si iperluken eme 2% seh ku 70% i bas sampel asli si mbelin sel-sel si nggeluh, janah proporsi sel-sel e tuhu-tuhu berbeda-beda antar pasien. Kenca ipisahken manik-manik e, pecahen si ipekaya si iperluken (CD4+, CD8+ ntah pe CD45-) lebih 85% i bas kerina sel si nggeluh i bas sampel e rata-rata. Metode pengayaan enda banci erbahanca kita banci menganalisis populasi sel arah metabolisme jaringan tumor manusia, si la mungkin ilakoken arah sampel si mbelin. Alu make protokol enda, itentuken kami maka l-kinurenin ras adenosin, dua metabolit imunosupresif si berkarakteristik si mehuli enda meningkat i bas sel T tumor ntah pe sel tumor (Gambar S3, B ras C). Emaka hasil enda ncidahken kesetiaan ras kemampuan teknologi pemisahan sel ras spektrometri massanta guna ndarami metabolit si penting secara biologis i bas jaringan pasien.
Analisis kami pe ncidahken pemisahan metabolisme si megegeh ibas jenis sel ibas ras antar pasien (Gambar 2D ras Gambar S4A). Secara khusus, adi ibandingken ras pasien si deban, pasien 70 ncidahken karakteristik metabolisme si berbeda (Gambar 2E ras Gambar S4B), si ncidahken maka banci saja lit heterogenitas metabolisme si substansial antar pasien. Perlu siteh adi ibandingken ras pasien si deban (1,2 seh ku 2 liter; Tabel S1), jumlah total asma si ipepulung i bas pasien 70 (80 ml) lebih kitik. Pengendalian heterogenitas antar pasien ibas analisis komponen utama (misalna, make analisis redundansi parsial) ncidahken perubahen si konsisten antara jenis sel, ras jenis sel ras/ntah pe lingkungen mikro jelas iagregasi sue ras profil metabolit (Gambar 2F ). Analisis metabolit tunggal menekanken efek-efek enda ras ncidahken perbedan si signifikan antara jenis sel ras lingkungen mikro. Perlu siteh perbedaan si paling ekstrim si iperhatiken eme MNA, si biasana ipebayak ibas sel CD45- ras ibas sel CD4+ ras CD8+ si menyusup ku tumor (Gambar 3A). Bagi sel CD4 +, efek enda paling jelas, janah MNA ibas sel CD8 + pe tempa-tempa megegeh ipengaruhi lingkungen. Tapi enda labo penting, erkiteken telu ngenca ibas enem pasien e banci i evaluasi skor CD8+ tumor. Selain MNA, ibas berbagai jenis sel ibas asma ras tumor, metabolit sideban si kurang berkarakteristik ibas TIL pe bayak secara berbeda (Gambar S3 ras S4). Emaka, data enda ncidahken sada rangkaian metabolit imunomodulator si menjanjiken guna penelitian selanjutna.
(A) Kandungan MNA si enggo normal i bas sel CD4+, CD8+ ras CD45- i bas asma ras tumor nari. Plot kotak ncidahken median (garis), rentang antarkuartil (engsel bingkai) ras rentang data, seh 1,5 kali rentang antarkuartil (kumis bingkai). Bagi si enggo ituriken ibas Bahan ras Cara Pasien, ipake nilai limma pasien guna nentuken nilai P (*P<0,05 ras **P<0,01). (B) Gambar skema kerna metabolisme MNA (60). Metabolit si lit i bas bahan enda: S-adenosil-1-metionin; SAH, S-adenosin-1-homosistein; NA, nikotinamida; MNA, 1-metilnikotinamida; 2-PY, 1-metil- 2-piridon-5-karboksamida; 4-PY, 1-metil-4-piridon-5-karboksamida; NR, nikotinamida ribosa; NMN, eme sada nukleotida si lit bas nikotinamida. Enzim (hijau): NNMT, nikotinamida N-metiltransferase; SIRT, kalak si erdahin; NAMPT, nikotinamida si ibahan i bas fosforibosil nari; AOX1, aldehida oksidase 1; NRK, nikotinamida ribosida kinase; NMNAT, nikotinamida mono Nukleotida adenilat si ipindahken; Pnp1, purin nukleosida fosforilase. (C) t-SNE scRNA-seq asma (abu-abu) ras tumor (merah; n = 3 pasien). (D) Ekspresi NNMT ibas populasi sel si berbeda si iidentifikasi alu make scRNA-seq. (E) Ekspresi NNMT ras AOX1 i bas SK-OV-3, ginjal embrio manusia (HEK) 293T, sel T ras sel T si irawat alu MNA. Ekspresi si ilipat e icidahken relatif ras SK-OV-3. Pola ekspresi alu SEM ituriken (n = 6 donatur si sehat). Nilai Ct lebih asangken 35 ianggap la terdeteksi (UD). (F) Ekspresi SLC22A1 ras SLC22A2 i bas SK-OV-3, HEK293T, sel T ras sel T si irawat alu MNA 8mM. Ekspresi si ilipat e icidahken relatif ras SK-OV-3. Pola ekspresi alu SEM ituriken (n = 6 donatur si sehat). Nilai Ct lebih asangken 35 ianggap la terdeteksi (UD). (G) Kandungan MNA sel ibas sel T donor si sehat si iaktifken kenca 72 jam inkubasi ras MNA. Pola ekspresi alu SEM ituriken (n = 4 donatur si sehat).
MNA ihasilken alu mindahken gugus metil ibas S-adenosil-1-metionin (SAM) nari ku nikotinamida (NA) alu nikotinamida N-metiltransferase (NNMT; Gambar 3B). NNMT iekspresiken alu berlebihen ibas erbage-bage kanker manusia ras ihubungken ras proliferasi, invasi ras metastasis (25-27). Guna lebih memahami sumber MNA ibas sel T ibas TME, ipake kami scRNA-seq guna mengkarakterisasi ekspresi NNMT lintas jenis sel ibas asma ras tumor telu pasien HGSC (Tabel S5). Analisis kurang lebih 6.500 sel ncidahken maka ibas lingkungen asma ras tumor, ekspresi NNMT terbatas ibas populasi fibroblas ras sel tumor si ianggap (Gambar 3, C ras D). Perlu siteh maka la lit ekspresi NNMT si jelas ibas populasi kai pe si mengekspresiken PTPRC (CD45 +) (Gambar 3D ras Gambar S5A), si ncidahken maka MNA si terdeteksi ibas spektrum metabolit enggo imasukken ku bas sel T. Ekspresi aldehida oksidase 1 (AOX1) ngubah MNA jadi 1-metil-2-piridon-5-karboksamida (2-PYR) ntah pe 1-metil-4-piridon-5-karboksamida (4- PYR); Gambar 3B) pe terbatas man populasi fibroblas si mengekspresiken COL1A1 (Gambar S5A), si radu ras ncidahken maka sel T kurang kemampuan metabolisme MNA konvensional. Pola ekspresi gen si berhubungan ras MNA enda iverifikasi alu make data sel independen si peduaken si ikumpulken arah asma i bas pasien HGSC nari (Gambar S5B; n = 6) (16). Selain si e, analisis reaksi berantai polimerase kuantitatif (qPCR) sel T donor si sehat si irawat alu MNA ncidahken maka adi ibandingken ras sel tumor ovarium SK-OV-3 kontrol, NNMT ntah pe AOX1 hampir la iekspresiken (Gambar 3E). Hasil si la isangka-sangka enda ncidahken maka MNA banci saja isekresiken arah fibroblas ntah pe tumor ku sel T si berdekatan i bas TME.
Aminna pe calon termasuk keluarga pengangkut kation organik 1 seh 3 (OCT1, OCT2 ras OCT3) si ikodeken keluarga pembawa larut 22 (SLC22) (SLC22A1, SLC22A2 ras SLC22A3), tapi potensi pengangkut MNA lenga bo itentuken (28) . QPCR mRNA ibas sel T donor si sehat nari ncidahken tingkat ekspresi SLC22A1 si rendah tapi tingkat SLC22A2 si la terdeteksi, si menegasken maka enggo pernah ilaporken ibas literatur (Gambar 3F) (29). Sebalikna, garis sel tumor ovarium SK-OV-3 ncidahken tingkat kedua transporter si tinggi (Gambar 3F).
Guna nguji kemungkinan sel T lit kemampuanna nyerep MNA asing, sel T donor si sehat ikulturken selama 72 jam alu litna konsentrasi MNA si berbeda. Adi la lit MNA eksogen, maka isi seluler MNA la banci ideteksi (Gambar 3G). Tapi, sel T si enggo iaktifken si irawat alu MNA eksogen ncidahken peningkatan kandungan MNA si bergantung ku dosis i bas sel-sel e, seh ku 6 mM MNA (Gambar 3G). Hasil enda ncidahken maka aminna pe tingkat ekspresi transporter rendah ras kurangna enzim utama si ertanggung jawab nandangi metabolisme MNA intraseluler, TIL tetap banci ngaloken MNA.
Spektrum metabolit ibas sel T pasien ras percobaan penyerapan MNA in vitro meningkatken kemungkinan fibroblas si berhubungen ras kanker (CAF) merembesken MNA ras sel tumor banci ngaturken fenotipe ras fungsi TIL. Guna nentuken pengaruh MNA nandangi sel T, sel T donor si sehat iaktifken secara in vitro alu lit ntah lang MNA, janah proliferasi ras produksi sitokinna i evaluasi. Kenca 7 wari itambahken MNA alu dosis si meganjangna, jumlah penggandaan populasi sedang berkurang, sedangken vigor tetap lit ibas kerina dosis (Gambar 4A). Selain si e, perawaten MNA eksogen erbahanca lit peningkatan proporsi sel T CD4 + ras CD8 + si mengekspresiken faktor nekrosis tumor-α (TNFα; Gambar 4B). Sebalikna, produksi intraseluler IFN-γ secara signifikan berkurang i bas sel CD4 + T, tapi labo i bas sel CD8 + T, janah la lit perubahen si signifikan i bas interleukin 2 (IL-2; Gambar 4, C ras D). Emaka, uji imunosorben si erkaiten ras enzim (ELISA) supernatan i bas kultur sel T si irawat alu MNA enda ncidahken peningkatan TNFα si signifikan, penurunan IFN-γ, ras la lit perubahen IL-2 (Gambar 4, E seh ku G). . Penurunan IFN-γ ncidahken maka MNA banci saja berperan i bas menghambat aktivitas anti-tumor sel T. Guna mensimulasiken efek MNA nandangi sitotoksisitas si imediasi sel T, sel reseptor antigen kimerik T (FRα-CAR-T) si menargetkan reseptor folat α ras CAR-T (GFP) si iaturken sel protein neon hijau (GFP) -CAR-T) ihasilken sel donor si sehat darah tepi mononuclear PBMC). Sel CAR-T ikulturken selama 24 jam alu lit MNA, kenca si e ikulturken bersama ras sel tumor ovarium SK-OV-3 manusia si mengekspresiken reseptor folat α alu rasio efektor ku target 10:1. Perawaten MNA erbahanca lit penurunen si signifikan ibas aktivitas pembunuhan sel FRα-CAR-T, si mirip ras sel FRα-CAR-T si irawat alu adenosin (Gambar 4H).
(A) Total jumlah sel si layak ras penggandaan populasi (PD) langsung arah kultur i bas wari 7. Grafik batang mewakili rata-rata + SEM i bas enem donor si sehat. Mewakili data ibas minimal n = 3 percobaan mandiri. (B seh ku D) CD3/CD28 ras IL-2 ipake guna ngaktifken sel T ibas konsentrasi MNA masing-masing selama 7 wari. Sope i analisis, sel-sel irangsang alu PMA/ionomisin alu GolgiStop selama 4 jam. Ekspresi TNFα (B) i bas sel T. Contoh gambar (kiri) ras data tabular (kanan) ekspresi TNFα ibas sel-sel si nggeluh. IFN-γ (C) ras IL-2 (D) si lit bas sel T. Ekspresi sitokin e iukur alu sitometri aliren. Grafik batang e merupaken rata-rata (n = 6 donatur si sehat) + SEM. Gunaken analisis varians searah ras pengukuren si iulang-ulang (*P<0,05 ras **P<0,01) guna nentuken nilai P. Mewakili data ibas minimal n = 3 percobaan mandiri. (E seh ku G) CD3/CD28 ras IL-2 ipake guna ngaktifken sel T ibas konsentrasi MNA masing-masing selama 7 wari. Media e ikumpulken ope ras kenca 4 jam stimulasi PMA/ionomisin. Konsentrasi TNFα (E), IFN-γ (F) ras IL-2 (G) iukur alu ELISA. Grafik batang e merupaken rata-rata (n = 5 donatur si sehat) + SEM. Nilai P itentuken alu make analisis varians searah ras pengukuren si iulang-ulang (*P<0,05). Garis titik-titik nuduhken batas deteksi deteksi. (H) Uji lisi sel. Sel FRα-CAR-T ntah pe GFP-CAR-T isesuaiken alu adenosin (250μM) ntah pe MNA (10 mM) selama 24 jam, ntah pe la irawat (Ctrl). Persentase pembunuhan sel SK-OV-3 iukurken. Nilai P itentuken alu uji t Welch (*P<0,5 ras **P<0,01).
Guna ndatken pemahamen mekanis kerna pengaturen ekspresi TNFα si bergantung ku MNA, i evaluasi perubahen mRNA TNFα sel T si irawat alu MNA (Gambar 5A). Sel T donor si sehat si irawat alu MNA ncidahken peningkatan dua kali lipat i bas kadar transkripsi TNFα, si ncidahken maka MNA bergantung ku pengaturen transkripsi TNFα. Guna menyelidiki mekanisme pengaturen si mungkin enda, dua faktor transkripsi si enggo iteh si ngaturken TNFα, eme faktor inti sel T si iaktifken (NFAT) ras protein spesifik 1 (Sp1), ievaluasi sebage respon nandangi pengikatan MNA ku promotor TNFα proksimal ( 30 ). Promotor TNFα lit 6 ingan pengikat NFAT si enggo iidentifikasi ras 2 ingan pengikat Sp1, tumpang tindih i bas sada ingan [-55 pasangan basa (bp) i bas 5’cap nari] (30). Imunopresipitasi kromatin (ChIP) ncidahken maka adi irawat alu MNA, pengikatan Sp1 ku promotor TNFα meningkat telu kali lipat. Penggabungan NFAT pe meningkat ras ndeher pentingna (Gambar 5B). Data enda ncidahken maka MNA ngaturken ekspresi TNFα arah transkripsi Sp1, ras i bas tingkat si lebih kitik ekspresi NFAT.
(A) Adi ibandingken ras sel T si ikulturken alu la lit MNA, perubahen lipat ekspresi TNFα i bas sel T si irawat alu MNA. Pola ekspresi alu SEM ituriken (n = 5 donatur si sehat). Mewakili data ibas minimal n = 3 percobaan mandiri. (B) Promotor TNFα sel T si irawat alu ntah pe la alu MNA 8 mM kenca NFAT ras Sp1 igabungken ras stimulasi (Ctrl) ras PMA/ionomisin selama 4 jam. Imunoglobulin G (IgG) ras H3 ipake sebage kontrol negatif ras positif guna imunopresipitasi, masing-masing. Kuantifikasi ChIP ncidahken maka pengikatan Sp1 ras NFAT ku promotor TNFα ibas sel si irawat alu MNA meningkat piga-piga kali lipat adi ibandingken ras kontrol. Mewakili data ibas minimal n = 3 percobaan mandiri. Nilai P itentuken alu piga-piga uji t (*** P <0,01). (C) Adi ibandingken ras asma HGSC, sel T (non-sitotoksik) ncidahken peningkatan ekspresi TNF i bas tumor. Warna-warna e mewakili pasien si berbeda. Sel-sel si itampilken enggo ibuat sampelna secara acak seh ku 300 ras i jitter guna membatasi overdrawing (** Padj = 0,0076). (D) Model MNA si iusulken guna kanker ovarium. MNA ihasilken ibas sel tumor ras fibroblas ibas TME ras ibuat sel T. MNA meningkatken pengikatan Sp1 ku promotor TNFα, si erbahanca meningkat transkripsi TNFα ras produksi sitokin TNFα. MNA pe erbahanca IFN-γ nurun. Penghambaten fungsi sel T erbahanca kemampuan munuh berkurang ras pertumbuhen tumor erpedas.
Menurut laporen, TNFα lit efek anti-tumor ras anti-tumor si bergantung ku lebe ras ku pudi, tapi lit peranna si terkenal i bas mendorong pertumbuhen ras metastasis kanker ovarium (31-33). Menurut laporen, konsentrasi TNFα ibas jaringan asma ras tumor ibas pasien kanker ovarium lebih tinggi asangken jaringan jinak (34-36). I bas segi mekanisme, TNFα banci ngaturken aktivasi, fungsi ras proliferasi sel darah putih, ras ngubah fenotipe sel kanker (37, 38). Sesuai ras hasil penemuan enda, analisis ekspresi gen diferensial ncidahken maka TNF secara signifikan up-regulate i bas sel T i bas jaringan tumor adi ibandingken ras asma (Gambar 5C). Peningkatan ekspresi TNF hanya teridah ibas populasi sel T si lit fenotipe non-sitotoksik (Gambar S5A). Singkatna, data enda mendukung pandangan maka MNA lit efek imunosupresif ras promosi tumor ganda i bas HGSC.
Pelabelen neon erpalasken aliren sitometri enggo jadi metode utama guna mpelajari metabolisme TIL. Penelitian enda enggo ncidahken maka adi ibandingken ras limfosit darah tepi ntah pe sel T i bas organ limfoid sekunder nari, TIL murine ras manusia lit kecenderunganna si lebih tinggi guna ngaloken glukosa (4, 39) ras hilangnya fungsi mitokondria secara bertahap (19, 40). Aminna pe enggo siperdiateken hasil si seri ibas penelitian enda, perkembangen kunci eme membandingken metabolisme sel tumor ras TIL ibas jaringan tumor si ireseksi si seri. Konsisten ras piga-piga laporen sebelumna enda, sel tumor (CD45-EpCAM +) ibas asma ras tumor nari lebih tinggi pengambilan glukosa asangken sel CD8 + ras CD4 + T, mendukung maka pengambilan glukosa sel tumor si tinggi banci ibandingken ras sel T. Konsep persaingen sel T. TME. Tapi, aktivitas mitokondria sel tumor lebih tinggi asangken sel CD8 + T, tapi aktivitas mitokondria mirip ras sel CD4 + T. Hasil enda mpegegehi tema si muncul maka metabolisme oksidatif penting man sel tumor (41, 42). Bagepe ikatakenna maka sel CD8 + T banci lebih rentan nandangi disfungsi oksidatif asangken sel CD4 + T, ntah pe sel CD4 + T banci make sumber karbon selain glukosa guna mempertahanken aktivitas mitokondria (43, 44). Perlu siteh maka siperdiateken labo lit perbedan pengambilan glukosa ntah pe aktivitas mitokondria antara efektor CD4 + T, memori efektor T ras sel memori sentral T ibas asma. Bagepe keadaan diferensiasi sel CD8 + T ibas tumor la lit hubungenna ras perubahen pengambilan glukosa, menyoroti perbedaan si signifikan antara sel T si ikulturken in vitro ras TIL manusia in vivo (22). Pengamatan enda pe ikonfirmasi alu make alokasi populasi sel otomatis si la bias, si lebih lanjut ncidahken maka sel CD45 + / CD3- / CD4 + / CD45RO + si lebih tinggi pengambilan glukosa ras aktivitas mitokondria asangken sel tumor si merajalela tapi lit populasi sel aktif Metabolik. Populasi enda banci mewakili subpopulasi si ianggap sel penekan mieloid ntah pe sel dendritik plasmasitoid si iidentifikasi i bas analisis scRNA-seq. Aminna pe duana enda enggo ilaporken ibas tumor ovarium manusia [45], tapi tetap perlu Kerja selanjutna eme nuriken subpopulasi mieloid enda.
Aminna pe metode berbasis flow cytometry banci memperjelas perbedan umum glukosa ras metabolisme oksidatif antar jenis sel, metabolit si tepat si ihasilken glukosa ntah pe sumber karbon si deban guna metabolisme mitokondria i bas TME lenga itentuken. Netapken lit ntah lang metabolit ku sada subset TIL tertentu perlu pemurnian populasi sel i bas jaringan si i eksisi nari. Emaka, metode pengayaan sel kami si ikombinasiken ras spektrometri massa banci mereken wawasen kerna metabolit si secara berbeda ipekaya i bas sel T ras populasi sel tumor i bas pencocoken sampel pasien. Aminna pe metode enda lit kelebihenna asangken penyortiren sel si iaktifken alu fluoresensi, perpustakaan metabolit tertentu banci terpengaruh erkiteken stabilitas si melekat ras/ntah pe tingkat perputaren si pedas (22). Amin bage gia, metode kami banci ngidentifikasi dua metabolit imunosupresif si iakui, adenosin ras kynurenin, erkiteken tuhu-tuhu berbeda antar jenis sampel.
Analisis metabonomi kami kerna tumor ras subtipe TIL mereken lebih mbue wawasen kerna peran metabolit i bas TME ovarium. Si pemena, alu make flow cytometry, itentuken kami maka la lit perbedan aktivitas mitokondria antara tumor ras sel CD4 + T. Tapi, analisis LC-MS/MS ncidahken perubahen si signifikan i bas kelimpahen metabolit i bas populasi enda, si ncidahken maka kesimpulen kerna metabolisme TIL ras aktivitas metabolisme secara keseluruhan perlu penafsiren si cermat. Si peduaken, MNA eme metabolit si mbelin perbedanna antara CD45-sel ras sel T ibas asma, labo tumor. Emaka, kompartementalisasi ras ingan tumor banci saja lit pengaruhna si berbeda nandangi metabolisme TIL, si menyoroti kemungkinan heterogenitas i bas lingkungen mikro tertentu. Si peteluken, ekspresi enzim penghasil MNA NNMT terutama terbatas ku CAF, eme sel tumor ibas tingkat si lebih kitik, tapi kadar MNA si banci ideteksi iperhatiken ibas sel T si berasal ibas tumor nari. Ekspresi NNMT si berlebihen i bas CAF ovarium lit efek si enggo iteh si banci erbahanca kanker, sebagin erkiteken promosi metabolisme CAF, invasi tumor ras metastasis (27). Aminna pe tingkat TIL secara keseluruhan sedang, ekspresi NNMT i bas CAF erhubungen erat erkiteken subtipe mesenkim Atlas Genom Kanker (TCGA), si erhubungen ras prognosa si la mehuli (27, 46, 47). Si terakhir, ekspresi enzim AOX1 si ertanggung jawab ibas degradasi MNA pe terbatas ibas populasi CAF, si ncidahken maka sel T kurang kemampuanna guna metabolis MNA. Hasil enda mendukung gagasen maka aminna pe perlu pendahin lebih lanjut guna memverifikasi penemuan enda, tingkat MNA si tinggi i bas sel T banci ncidahken litna lingkungen mikro CAF si imunosupresif.
Inget tingkat ekspresi transporter MNA si rendah ras tingkat protein kunci si la terdeteksi si terlibat ibas metabolisme MNA, kehadiren MNA ibas sel T la isangka-sangka. Baik NNMT bagepe AOX1 la banci ideteksi alu analisis scRNA-seq ras qPCR si itargetkan dua kohort independen. Hasil enda ncidahken maka MNA labo isintesis sel T, tapi iserap arah TME si lit i sekelewetna. Percobaan in vitro ncidahken maka sel T cenderung menumpuk MNA eksogen.
Studi in vitro kami enggo ncidahken maka MNA eksogen menginduksi ekspresi TNFα i bas sel T ras meningkatken pengikatan Sp1 ku promotor TNFα. Aminna pe TNFα lit fungsina anti tumor ras anti tumor, tapi ibas kanker ovarium, TNFα banci mendorong pertumbuhen kanker ovarium (31-33). Netralisasi TNFα ibas kultur sel tumor ovarium ntah pe penghapusan sinyal TNFα ibas model tikus banci meningkatken produksi sitokin inflamasi si imediasi TNFα ras menghambat pertumbuhen tumor (32, 35). Emaka ibas hal enda, MNA si berasal ibas TME nari banci bertindak sebage metabolit pro-inflamasi arah mekanisme si bergantung man TNFα arah loop autokrin, alu bage mendorong terjadina ras penyebaran kanker ovarium (31). Erpalasken kemungkinen enda, blokade TNFα sangana ipelajari sebage agen terapi si berpotensi man kanker ovarium (37, 48, 49). Selain si e, MNA ncedai sitotoksisitas sel CAR-T nandangi sel tumor ovarium, si mereken bukti lebih lanjut kerna penekanan imun si imediasi MNA. Secara kolektif, hasil enda ncidahken sada model i ja tumor ras sel CAF merembesken MNA ku TME ekstraseluler. Arah (i) stimulasi pertumbuhen kanker ovarium si ibahan TNF ras (ii) penghambaten aktivitas sitotoksik sel T si ibahan MNA, enda banci lit efek tumor ganda (Gambar 5D).
Kesimpulenna, alu nerapken kombinasi pengayaan sel si pedas, uruten sel tunggal ras profiling metabolisme, penelitian enda ncidahken perbedan imunometabolomik si mbelin antara tumor ras sel asma i bas pasien HGSC. Analisis si komprehensif enda ncidahken maka lit perbedan pengambilan glukosa ras aktivitas mitokondria antara sel T, ras iidentifikasi MNA sebage metabolit pengatur imun otonom non-sel. Data enda berdampak kuga TME mpengaruhi metabolisme sel T ibas kanker manusia. Aminna pe persaingen langsung guna nutrisi antara sel T ras sel kanker enggo ilaporken, metabolit pe banci bertindak sebage pengatur si la langsung guna mendorong perkembangen tumor ras mungkin menekan respon imun endogen. Penjelasen selanjutna kerna peran fungsional metabolit pengatur enda banci membuka strategi alternatif guna meningkatken respon imun anti tumor.
Spesimen pasien ras data klinis idatken arah repositori jaringan tumor kanker SM si isertifikasi Jaringan Repositori Jaringan Kanada. Menurut protokol si isetujui Komite Etika Penelitian Kanker SM ras Universitas British Columbia (H07-00463), kerina spesimen ras data klinis pasien ndatken persetujun tertulis si enggo ibereken informasi ntah pe secara resmi ngelepasken persetujunna. Sampelna isimpan i bas BioBank si enggo isertifikasi (BRC-00290). Karakteristik pasien si rinci ituriken ibas Tabel S1 ras S5. Guna kriopreservasi, ipake pisau bedah guna nguraiken sampel tumor pasien alu mekanis kenca si e idorongna arah saringan si belangna 100 mikron guna ndatken suspensi sel si sada. Asma pasien i sentrifugasi alu 1500 rpm selama 10 menit ibas suhu 4°C guna pelet sel-sel ras mbuang supernatan. Sel-sel si idatken arah tumor ras asma i kriopreservasi i bas serum AB manusia si inaktifken alu panas 50% (Sigma-Aldrich), 40% RPMI-1640 (Thermo Fisher Scientific) ras 10% dimetil sulfoksida. Suspensi sel tunggal si iawetken enda icairken ras ipake guna metabolomik ras penentuan metabolit si ituriken i teruh enda.
Media si lengkap terdiri ibas 0,22 μm si isaring 50:50 itambahi RPMI 1640: AimV. RPMI 1640 + 2,05 mM l-glutamin (Ilmiah Termo Fisher) itambahi alu 10% serum AB manusia si inaktifken panas (Sigma-Aldrich), Hepes 12,5 mM (Ilmiah Fisher Termo), 2 mM l-glutamin (Ilmiah Termo Fisher). Larutan streptomisin (PenStrep) ras 50 μMB-merkaptoetanol. AimV (Invitrogen) itambahi alu Hepes 20 mM (Ilmiah Termo) ras l-glutamin 2 mM (Ilmiah Termo). Penyangga pewarnaan sitometer aliren terdiri ibas saline penyangga fosfat si isaring 0,22μm (PBS; Invitrogen) si itambahi alu serum manusia AB si inaktifken alu panas 3% (Sigma). Penyangga pengayaan sel terdiri ibas PBS si enggo isaring 0,22μm ras itambahi alu serum AB manusia si inaktifken alu panas 0,5% (Sigma-Aldrich).
I bas media lengkap 37°C, sel-sel iwarnai alu 10 nM MT DR ras 100 μM 2-NBDG selama 30 menit. Selanjutna, sel-sel e iwarnai alu pewarna viabilitas eF506 i bas suhu 4°C selama 15 menit. Suspendken mulihi sel-sel e i bas Blok FC (eBioscience) ras Penyangga Noda Brilian (BD Biosciences), encerken i bas penyangga pewarnaan aliren sitometer (menurut petunjuk pabrikan), janah inkubasiken 10 menit i bas suhu kamar. Nodai sel-sel alu sada set antibodi (Tabel S2) ibas penyangga pewarnaan sitometri aliren ibas suhu 4°C selama 20 menit. Isuspensi mulihi sel-sel e i bas penyangga pewarnaan sitometri aliren (Cytek Aurora; konfigurasi 3L-16V-14B-8R) ope denga ianalisis. Gunaken SpectroFlo ras FlowJo V10 guna nganalisis data jumlah sel, ras gunaken GraphPad Prism 8 guna erbahan data e. Intensitas fluoresensi median (LKM) 2-NBDG ras MT DR i log-normalisasi, kenca si e igunaken uji t berpasangan guna analisis statistik guna mpertanggungjawabken pasien si cocok. Ibuat kerina populasi si kurang asangken 40 peristiwa i bas analisis nari; masukken nilai LKM 1 guna nilai negatif kai pe ope denga ilakoken analisis statistik ras visualisasi data.
Guna melengkapi strategi gating manual panel proses i datas, ipake kami anotasi lengkap alu pohon pembatasen bentuk (FAUST) (21) guna secara otomatis menetapken sel-sel ku populasi kenca enggo ihilangkan sel-sel si mate i bas FlowJo. Kita secara manual ngaturken output guna nggabungken populasi si tempa-tempa salah alokasi (menggabungken PD1+ ras sel PD1-tumor) ras populasi si ipetahanken. Tiap sampel lit rata-rata lebih 2% sel, guna total 11 populasi.
Sentrifugasi kepadaten gradien ficoll ipake guna misahken PBMC ras produk pemisahan leukosit (Teknologi STEMCELL). Sel CD8 + T isolasi ibas PBMC nari alu make CD8 MicroBeads (Miltenyi) ras ipebelin ibas media lengkap alu make TransAct (Miltenyi) selama 2 minggu sue ras petunjuk pabrikan. Sel-sel e ibereken tedis 5 wari i bas media lengkap si mengandung IL-7 (10 ng/ml; PeproTech), kenca si e irangsang mulihi alu TransAct. I bas wari si pe-7-ken, sue ras petunjuk pabriken, ipake CD45 MicroBeads manusia (Miltenyi) guna mpebayak sel-sel i bas telu putaren si erturut-turut. Sel-sel e i aliquot guna analisis flow cytometry (bagi si enggo ituriken i datas), janah sada juta sel i aliquot telu kali guna analisis LC-MS/MS. Sampel-sampel e iproses alu LC-MS/MS bagi si ituriken i teruh enda. Iperkiraken kami nilai metabolit si kurang alu jumlah ion 1.000. Tiap sampel inormalisasi alu jumlah ion total (TIC), iubah secara logaritmik ras otomatis inormalisasi i bas MetaboAnalystR ope denga i analisis.
Suspensi sel tunggal tiap pasien icairken ras isaring alu saringan 40 μm ku media lengkap (bagi si enggo ituriken i datas). Menurut protokol pabrikan, telu putaren berturut-turut seleksi positif alu pemisahan manik magnetik alu make MicroBeads (Miltenyi) ipake guna mpebayak sampel guna sel CD8+, CD4+ ras CD45- (i datas es). Singkatna, sel-sel e isuspensi mulihi i bas penyangga pengayaan sel (bagi si enggo ituriken i datas) janah ibilang. Sel-sel e iinkubasi alu manik-manik CD8 manusia, manik-manik CD4 manusia ntah pe manik-manik CD45 manusia (Miltenyi) i bas suhu 4°C selama 15 menit, kenca si e icuci alu penyangga pengayaan sel. Sampel e ilewati kolom LS (Miltenyi), janah pecahen positif ras negatif ipepulung. Guna ngurangi durasi ras memaksimalken langkah pemulihen sel, maka CD8-fraksi e ipake guna putaren pengayaan CD4+ si peduaken, janah CD4-fraksi e ipake guna pengayaan CD45-selanjutna. Jagalah larutan e i datas es sepanjang proses pemisahan.
Guna nikapken sampel guna analisis metabolit, sel-sel e icuci sekali alu larutan garam si dingin bagi es, janah 1 ml metanol 80% itambahken ku tep-tep sampel, kenca si e i vortex ras i snap frozen i bas nitrogen cair. Sampel e ibahan telu siklus beku-cair ras isentrifugasi alu 14.000 rpm selama 15 menit alu suhu 4°C. Supernatan si lit metabolitna iuapken seh kering. Metabolit e ilarutken mulihi ibas 50 μl asam formik 0,03%, i vortex guna icampur, kenca e i sentrifugasi guna mbuang puing-puing.
Ekstrak metabolit bagi si enggo ituriken ndai. Pindahken supernatan ku botol kromatografi cair si berkinerja tinggi guna penelitian metabolomik. Gunaken protokol perawatan acak guna merawat tiap sampel alu jumlah sel si seri guna mencegah efek batch. Ibahan kami penilaian kualitatif metabolit global si enggo iterbitken sebelumna i bas Spektrometer Massa Kuadrupol Tiga AB SCIEX QTRAP 5500 (50). Analisis kromatografi ras integrasi daerah puncak ilakoken alu make perangkat lunak MultiQuant versi 2.1 (Biosistem Terapan SCIEX).
Hitungen ion 1000 ipake guna memperkiraken nilai metabolit si kurang, ras TIC tiap sampel ipake guna menghitung luas puncak si enggo normalisasi tiap metabolit si terdeteksi guna memperbaiki perubahen si ipetandaken alu analisis instrumental arah pengolahen sampel. Kenca TIC enggo normalisasi, MetaboAnalystR(51) (parameter bawaan) ipake guna konversi logaritmik ras skala garis norma otomatis. Igunaken kami PCA alu paket R vegan guna ngelakoken analisis eksploratif perbedan metabolom antara jenis sampel, ras ipake kami analisis redundansi parsial guna nganalisis pasien. Gunaken metode Ward guna membangun dendrogram peta panas guna ngkelompokken jarak Euclidean antar sampel. Igunaken kami limma (52) kerna kelimpahen metabolit si enggo ibakuken guna ngidentifikasi metabolit si berbeda-beda kelimpahenna i bas kerina jenis sel ras lingkungen mikro. Guna mpermudah penjelasen, ipake kami parameter rata-rata kelompok guna nentuken model, ras ipertimbangkan jenis sel ibas lingkungen mikro sebage tiap kelompok (n = 6 kelompok); guna tes signifikansi, ilakoken kami telu pengukuren si iulang-ulang man tep-tep metabolit Guna menghindari replikasi palsu, pasien imasukken jadi penghalang i bas desain limma. Guna mereksa perbedan metabolit antara pasien si berbeda, isesuaiken kami model limma termasuk pasien alu cara si tetap. Kami melaporken signifikansi kontras si enggo itentuken lebe antara jenis sel ras lingkungen mikro Padj <0,05 (koreksi Benjamini-Hochberg).
Kenca pengayaan vigor alu make Kit Penghapusan Sel Mati Miltenyi (>80% viabilitas), uruten transkriptom sel tunggal ilakoken ku total sampel asma ras tumor beku si nggeluh alu make protokol ekspresi gen 10x 5′. Lima kasus si cocok ras tumor ras asma ianalisis, aminna pe viabilitas si rendah i bas sada sampel tumor nari erbahanca la banci imasukken. Guna ndatken piga-piga seleksi pasien, igabungken kami sampel tep-tep pasien i bas jalur-jalur kontroler kromium 10x, janah ianalisis ingan asma ras tumor secara terpisah. Kenca enggo iurutken [Illumina HiSeq 4000 28×98 bp ujung si erpasangen (PE), genom Quebec; rata-rata 73.488 ras 41.378 bacaan per sel guna tumor ras asma masing-masing]], kami make CellSNP ras Vireo (53) (erpalasken CellSNP sebagai SNP manusia umum (VCF) si isediaken GRCh38 itugasken identitas genotipe donor (status pasien close's) (IBS), la termasuk sel-sel si la itugasken ras sel-sel si iidentifikasi sebage dupleks ras donor si cocok antara sampel asma ras tumor (54 Erpalasken tugas enda, ipetahanken kami telu kasus si melala representasi selna i bas tumor ras asma guna analisis hilir (scCoran scactor enda ras)6. hasilna 6975 sel (2792 ras 4183 sel i bas tumor ras ascites nari, masing-masing) guna ianalisis Kita make igraph (57) Pengelompoken Louvain jaringan tetangga terdekat si ibagiken (SNN) erpalasken jarak Jaccard ku sel-sel si erkelompok alu ekspresi annoker secara manual. ras ivisualken alu t-SNE Sel T sitotoksik itentuken alu ekspresi CD8A ras GZMA, la termasuk subkluster si ekspresi protein ribosomna rendah Kami mengakses data si iterbitken Izar dkk (16), termasuk penyematan t-SNE-na, banci mengendaliken ekspresi tumpang tindih antara sel imun.
PBMC ipisahken ibas produk pemisahan leukosit (Teknologi STEMCELL) alu sentrifugasi kepadaten gradien Ficoll. Sel CD3 + isolasi ibas PBMC nari alu make manik-manik CD3 (Miltenyi). Adi lit ntah lang MNA, sel CD3+ iaktifken alu CD3 si terikat ku lempeng (5μg/ml), CD28 si larut (3μg/ml) ras IL-2 (300 U/ml; Proleukin). I bas wari terakhir ekspansi, kelangsungan hidup (Pewarna Kelangsungan Hidup si Banci Tetap eFluor450, eBiosains) ras proliferasi (123hitungen eManik-manik, Thermo Fisher Ilmiah) ievaluasi alu sitometri aliren. Ngevaluasi fungsi efektor alu merangsang sel alu PMA (20 ng/ml) ras ionomisin (1 μg/ml) alu GolgiStop selama 4 jam, ras memantau CD8-PerCP (RPA-T8, BioLegend), CD4-AF700 (RPA-T4) , BioLegend (Mab11, BD). Irangsang sel qPCR ras ChIP alu PMA (20 ng/ml) ras ionomisin (1μg/ml) selama 4 jam. Supernatan ELISA ipepulung ope ras kenca stimulasi alu PMA (20 ng/ml) ras ionomisin (1 μg/ml) selama 4 jam.
Ikutkenlah protokol pabrik guna ngisolasi RNA alu make RNeasy Plus Mini Kit (QIAGEN). Gunaken alat penghancur QIA (QIAGEN) guna homogenken sampel e. Gunaken kit RNA ku cDNA si berkapasitas tinggi (Thermo Fisher Ilmiah) guna sintesis DNA pelengkap (cDNA). Gunaken TaqMan Rapid Advanced Master Mix (Thermo Fisher Scientific) guna ngukur ekspresi gen (menurut protokol pabriken) alu probe si tersena i teruh enda: I bas bahan enda, ijelasken uga carana nggunaken gliseraldehida-3-fosfat i bas Hidrogen (GAPDH) nari. Sampel-sampel e idalanken alu sistem PCR waktu nyata StepOnePlus (Biosistem Terapan) (Biosistem Terapan) i bas pelat reaksi 96 sumur optik cepat MicroAmp (Biosistem Terapan) alu film optik MicroAmp. Nilai Ct si lebih 35 ianggap i datas ambang batas deteksi ras itandaina la terdeteksi.
Lakoken ChIP bagi si enggo ituriken ndai (58). Singkatna, sel-sel e irawat alu formaldehida (konsentrasi akhir 1,42%) ras iinkubasi ibas suhu kamar selama 10 menit. Gunaken penyangga pembengkaken si itambahi (Hepes 25 mM, MgCl2 1,5 mM, KCl 10 mM ras NP-40 0,1%) i datas es selama 10 menit, kenca si e isuspensi mulihi i bas penyangga imunopresipitasi bagi si enggo ituriken (58 ). Sampel e kenca si e i sonikasi alu siklus-siklus si tersena i teruh enda: 10 siklus (20 pulsa 1 detik) ras waktu statis 40 detik. Inkubasi antibodi imunoglobulin G (Teknologi Pensinyalen Sel; 1 μl), histon H3 (Teknologi Pensinyalen Sel; 3 μl), NFAT (Invitrogen; 3 μl) ras SP1 (Teknologi Pensinyalen Sel; 3 μl) alu sampel si lebih berat CC. Inkubasi manik-manik protein A (Thermo Fisher Scientific) ras sampel ibas suhu 4°C alu goyang-goyang lembut selama 1 jam, kenca si e pake manik-manik chelex (Bio-Rad) guna mpebayak DNA, ras pake proteinase K (Thermo Fisher) guna pencernaan protein. Promotor TNFα i deteksi alu PCR: maju, GGG TAT CCT TGA TGC TGT TGT; sebalikna, GTG CCA ACA AKTA GCC TTT ATA TG (produk 207 bp). Gambar-gambar e ibahan Image Lab (Bio-Rad) ras iukur alu make perangkat lunak ImageJ.
Supernatan kultur sel e ikumpulken bagi si enggo ituriken ndai. Penentuan e ilakoken rikutken prosedur pabrik alat ELISA TNFα manusia (Invitrogen), alat ELISA IL-2 manusia (Invitrogen) ras alat ELISA IFN-γ manusia (Abcam). Rikutken protokol pabrik, supernatan e i encerken 1:100 guna ndatken TNFα ras IL-2, ras 1:3 guna ndatken IFN-γ. Igunakenna alat pembaca multilabel (PerkinElmer) guna ngukur daya serap i bas 450 nm.
PBMC ipisahken ibas produk pemisahan leukosit (Teknologi STEMCELL) alu sentrifugasi kepadaten gradien Ficoll. Sel CD3 + isolasi ibas PBMC nari alu make manik-manik CD3 (Miltenyi). Adi lit ntah lang MNA, sel CD3+ iaktifken alu CD3 si terikat ku lempeng (5μg/ml), CD28 si larut (3μg/ml) ras IL-2 (300 U/ml; Proleukin) selama 3 wari. Kenca 3 wari, sel-sel e ikumpulken ras icuci alu saline 0,9%, janah pelet e i snap frozen. Penghitungen sel ilakoken alu cara sitometri aliren (Cytek Aurora; konfigurasi 3L-16V-14B-8R) alu make 123hitungen eBeads.
Ekstrak metabolit bagi si enggo ituriken ndai. Ekstrak si enggo kering e i rekonstitusi alu konsentrasi 4000 setara sel/μl. 1290 Infinity II, Teknologi Agilent, Santa Clara, CA) ras kolom CORTECS T3 (2,1×150 mm, ukuren partikel 1,6-μm, ukuren pori-pori 120-Å; #186008500, #186008500). Spektrometer massa kutub (6470, Agilent), i ja ionisasi elektrosemprot beroperasi alu mode positif. Fase A si bergerak eme 0,1% asam formik (ibas H2O), fase B si bergerak eme 90% asetonitril, 0,1% asam formik. Gradien LC eme 0 seh ku 2 menit guna 100% A, 2 seh ku 7,1 menit guna 99% B, ras 7,1 seh ku 8 menit guna 99% B. Kenca bage i seimbangken mulihi kolom ras fase mobile A alu laju aliren 0,6 ml/menit selama 3 menit. . Laju alirenna 0,4ml/min, janah ruang kolom e ipemanas seh 50°C. Gunaken standar kimia murni MNA (M320995, Perusahaan Kimia Penelitian Toronto, York Utara, Ontario, Kanada) guna netapken waktu retensi (RT) ras perubahen (RT = 0,882 menit, perubahen 1 = 137→94,1, perubahen 2 = 137, perubahen→373). Adi teluna transisi e terjadi ibas waktu retensi si benar, maka transisi 1 ipake guna kuantifikasi guna memastikan spesifisitas. Kurva standar MNA (Perusahaan Kimia Penelitian Toronto) ihasilken alu enem pengenceren seri larutan saham (1 mg/ml) guna ndatken standar 0,1, 1,0, 10 ras 100 ng/ml ras 1,0 ras 10μg/ml masing-masing cair. Batas deteksi eme 1 ng/ml, janah respon linier antara 10 ng/ml ras 10μg/ml. Tiap suntikan dua mikroliter sampel ras standar ipake guna analisis LC/MS, ras sampel kontrol kualitas campuren idalanken tiap waluh suntikan guna memastikan stabilitas platform analisis. Respon MNA kerina sampel sel si irawat alu MNA lit ibas rentang linier assay. Analisis data ilakoken alu make perangkat lunak analisis kuantitatif MassHunter (v9.0, Agilent).
Konstruk αFR-CAR generasi si peduaken ibuat i bas Song dkk nari. (59). Singkatna, konstruk e isina eme: uruten pemimpin CD8a, fragmen variabel rantai tunggal spesifik αFR manusia, daerah engsel ras transmembran CD8a, domain intraseluler CD27 ras domain intraseluler CD3z. Uruten CAR si lengkap isintesis alu GenScript, kenca si e ikloning ku vektor ekspresi lentivirus generasi peduaken i hulu kaset ekspresi GFP si ipake guna ngevaluasi efisiensi transduksi.
Lentivirus ihasilken alu transfeksi sel HEK293T [Koleksi Budaya Tipe Amerika (ATCC); itumbuhken i bas media Eagle si imodifikasi Dulbecco si mengandung 10% serum janin sapi (FBS) ras 1% PenStrep, janah ipake vektor CAR-GFP ras Plasmid kemasan (psPAX2 ras pMD2.G, Addgene) make amina lipofeksi (Sigma-Aldrich). Supernatan si mengandung virus e ikumpulken 48 ras 72 jam kenca transfeksi, isaring, ras ikonsentrasiken alu ultrasentrifugasi. Simpan supernatan virus si enggo ipekat i bas suhu -80°C seh transduksi.
PBMC ipisahken ibas produk pemisahan leukosit donor si sehat (Teknologi STEMCELL) alu sentrifugasi kepadaten gradien Ficoll. Gunaken mikromanik CD8 seleksi positif (Miltenyi) guna ngisolasi sel CD8+ ibas PBMC nari. Merangsang sel T alu TransAct (Miltenyi) ras i bas media TexMACS [Miltenyi; itambahi alu 3% serum manusia si la iaktifken alu panas, 1% PenStrep ras IL-2 (300 U/ml)]. Dua puluh empat jam kenca stimulasi, sel T i transduksi alu lentivirus (10 μl supernatan virus pekat per 106 sel). 1 seh ku 3 wari kenca transduksi i bas Cytek Aurora (i bas FSC (Penyebaran Maju)/SSC (Penyebaran Samping), Singlet, GFP+), evaluasi ekspresi GFP sel-sel guna ncidahken efisiensi transduksi sitikna 30% .
Sel CAR-T ikulturken selama 24 jam i bas Immunocult (Teknologi STEM; itambahi alu 1% PenStrep) i bas kondisi si tersena i teruh enda: la irawat, irawat alu adenosin 250 μM ntah pe MNA 10 mM. Kenca enggo ibahan praperlakuan, sel CAR-T icuci alu PBS janah igabungken ras 20.000 sel SK-OV-3 [ATCC; i bas media McCoy 5A (Sigma-Aldrich) si itambahi alu 10% FBS ras 1% PenStrep i bas 10: Rasio efektor ras sasaran 1 iperkuat alu telu kali lipat i bas media Imunokult si itambahi. Sel SK-OV-3 ras sel SK-OV-3 si ilis alu saponin digitalis (0,5mg/ml; Sigma-Aldrich) ipake jadi kontrol negatif ras positif, masing-masing. Kenca 24 jam ko-kultivasi, supernatan ipepulung ras iukur laktat dehidrogenase (LDH) sue ras petunjuk pabrikan (Kit Uji Sitotoksisitas LDH Glo, Promega). Supernatan LDH e i encerken 1:50 ibas penyangga LDH. Persentase pembunuhan iukur alu make rumus enda: persentase pembunuhan = persentase koreksi/tingkat pembunuhan maksimal x 100%, i ja persentase koreksi = ko-kultur-sel T saja, ras tingkat pembunuhan maksimal = kontrol positif-kontrol negatif.
Bagi si enggo ituriken ibas teks ntah pe bahan ras cara, pakelah GraphPad Prism 8, Microsoft Excel ntah pe R v3.6.0 guna analisis statistik. Adi piga-piga sampel ibuat i bas pasien si seri (misalna asma ras tumor), ipake kami tes t si erpasangen ntah pe imasukken kami pasien e jadi efek acak i bas model linier ntah pe umum sue ras si patut. Guna analisis metabolomik, uji kepentingen ilakoken alu telu kali lipat.
Guna bahan tambahen guna artikel enda, banci idahndu i bas http://advances.sciencemag.org/cgi/isi/lengkap/7/4/eabe1174/DC1.
Enda me sada artikel akses terbuka si ibagiken alu ketentuan Lisensi Atribusi-Non-Komersial Creative Commons, si banci ipake, ibagiken ras ireproduksi i bas media kai pe, asalken penggunaan akhir labo guna keuntungen komersial ras premisna eme maka karya aslina benar. Referensi.
Cataten: Kami hanya mindo gelah iberekenndu alamat emailndu gelah kalak si irekomendasikenndu ku halaman e meteh maka atendu idahna email e janah labo spam. Labo itangkap kami alamat email si lit.
Penungkunen enda ipake guna nguji kam pengunjung ntah lang ras mencegah pengirimen spam otomatis.
Marisa K. Kilgour (Marisa K. Kilgour), Sarah MacPherson (Sarah MacPherson), Lauren G. Zacharias (Lauren G. Zacharias), Abigail Eli Aris G. Watson (H. Watson), John Stagg (John Stagg), Brad H. Jonesph (John Stagg), Brad H. Jonesal (Brad H. Nelson), Ralph J. (Rusel G. Jones), Pineas T. Hamilton (Pineas T.
MNA berkontribusi ibas penekanan imun sel T ras mewakili target imunoterapi si berpotensi guna pengobatan kanker manusia.
Marisa K. Kilgour (Marisa K. Kilgour), Sarah MacPherson (Sarah MacPherson), Lauren G. Zacharias (Lauren G. Zacharias), Abigail Eli Aris G. Watson (H. Watson), John Stagg (John Stagg), Brad H. Jonesph (John Stagg), Brad H. Jonesal (Brad H. Nelson), Ralph J. (Rusel G. Jones), Pineas T. Hamilton (Pineas T.
MNA berkontribusi ibas penekanan imun sel T ras mewakili target imunoterapi si berpotensi guna pengobatan kanker manusia.
©2021 Asosiasi Amerika guna Kemajun Ilmu Pengetahuan. kerina hak cipta lit i bas ia. AAAS eme mitra HINARI, AGORA, OARE, KOOR, JAMSS, Ref Silang ras PENGHITUNG. Kemajun Ilmu Pengetahuan ISSN 2375-2548.